一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，该方法建立了在DSS急性结肠炎模型中联用艰难梭菌(Clostridium difficile)的炎症转化模型，通过不同的给菌方式，包括腹腔注射、灌胃、灌肠三种手段。该模型优势在于该模型能够显著增加小鼠肠系膜淋巴细胞Th17的比例，并且上调IL‑17的分泌；更接近于临床溃疡性结肠炎患者的病理学特征；小鼠通过灌胃给艰难梭菌的效果最好。

【技术实现步骤摘要】
一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法
本专利技术涉及动物模型的构建方法，特别涉及一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridiumdiffficile)是一种孢子形成，革兰氏阳性，厌氧菌，其在1978年被确定为抗生素相关伪膜性结肠炎病因的细菌[Antibiotic-associatedpseudomembranouscolitisduetotoxin-producingclostridia.N.Engl.J.Med.298，531-534]。尽管过去35年来传染病死亡率总体下降，但美国腹泻病死亡率仍在上升。这一趋势归因于过去十年中艰难梭菌(Clostridiumdifficile)超强毒株的传播，也包括研究中使用的流行型核糖体027菌株[BinarytoxinanddeathafterClostridiumdifficileinfection.Emerg.Infect.Dis.17，976-982]。美国疾病控制和预防中心估计仅在美国艰难梭菌每年就会导致近500000例感染和29000例死亡。这些报告和其他报告强调了研究艰难梭菌感染(CDI)和确定降低疾病严重程度的治疗靶点的重要性[EmergingInfectionsProgramC.difficileSurveillanceTeam(2015).BurdenofClostridiumdifficileinfectionintheUnitedStates.N.Engl.J.Med.372，2369-2370]。溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis，UC)：慢性炎症疾病，特点表现为直肠与结肠中的连续黏膜溃疡，起始于直肠，不同程度地扩展，最长可以蔓延到盲肠，其临床表现为腹泻、间断性便血或脓血便、腹痛、呕吐等。但是，其病因至今仍未确定，普遍认为是受到环境、遗传和肠道微生物等因素的影响[Increasingincidenceandprevalenceoftheinflammatoryboweldiseaseswithtime，basedonsystematicreview.Gastroenterology2012；142：46-54，e42]。其中IBD是CDI的独立危险因素。与非IBD患者相比，IBD患者的CDI更为严重，表现为从入院到CDI的时间缩短、住院时间延长、手术次数增加和住院死亡率增加[IncidenceofClostridiumdifficileinfectionininflammatoryboweldisease.Clin.Gastroenterol.Hepatol.5，339-344]。现有的溃疡性结肠炎(UC)模型常见的动物模型主要为：葡聚糖硫酸钠(DSS)模型、2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)模型。DSS诱导的结肠炎模型其发病机制DSS是由蔗糖合成的硫酸多糖体，其诱导结肠炎的机制可能与影响DNA合成，通过各种途径造成T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等激活，引起细胞因子表达改变，导致肠上皮屏障破坏有关[Temporalandspatialanalysisofclinicalandmolecularparametersindextransodiumsulfateinducedcolitis.PLoSOne，2009，4(6)：e6073]。DSS结肠炎表现为浅表性、局灶性炎症和溃疡，全结肠均可发病，炎症主要累及黏膜层和黏膜下层。但是，DSS急性结肠炎模型制作过程中动物死亡率高，停药后8～9d症状自然恢复，影响药物疗效观察，因此适用于发病机制的研究。TNBS结肠炎动物模型发病机制是由乙醇破坏肠黏膜屏障后，TNBS渗入结肠组织，与大分子物质结合形成全抗原，引起肠黏膜的一系列免疫和炎症反应[AReviewonChemical-InducedInflammatoryBowelDiseaseModelsinRodents.KoreanJPhysiolPharmacol，2014，18(4)：279-288]。但是，TNBS模型需严格控制剂量，该模型与Crohn’s病(Crohn’sdisease，CD)更为相似，与溃疡性结肠炎相似程度低。目前，针对溃疡性结肠炎的药物研发遇到的主要问题在于，针对免疫反应相关分子和肠道免疫过程的药物靶标发现。随着TNF-α抗体药物在UC中应用的日趋成熟，靶向免疫反应相关分子和肠道免疫过程的药物引发关注，但是其伴随的问题是耐药性的增加。在UC患者的结肠粘膜中IL-17水平较高[InterleukinsIL-33andIL-17/IL-17Ainpatientswithulcerativecolitis.Hepatogastroenterology，2010，57(104)：1442-1444]。这提示IL-17可作为UC的治疗靶点。然而，经典的DSS诱导结肠炎动物模型存在的问题在于小鼠结肠中IL-17的水平并没有显著的增加。因此，需要构建一种新型溃疡性结肠炎转化模型，能够模拟临床溃疡性结肠患者结肠粘膜中IL-17的水平。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术目的是提供一种DSS诱导并联用C.difficile的溃疡性结肠炎转化动物模型。技术方案：本专利技术提供一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，先让小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)，再通过不同途径给艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，之后进行观察和生化指标测定，当出现小鼠结肠中Th1或Th17的数量增加、结肠组织中IL-17的表达增加和炎症因子的表达上调时，则模型构建成功。进一步地，所述小鼠使用雄性小鼠，相较于雌鼠，雄性性别小鼠受内分泌因素影响较小，体重均一性与造模稳定性更优。进一步地，所述不同途径为腹腔注射、灌胃或灌肠。通过上述各途径进行菌液感染。进一步地，所述途径优选为灌胃。进一步地，所述先让小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)7天，在第8天停止，再给艰难梭菌(Clostridiumdifficile)。在DSS急性结肠炎模型下，小鼠肠道内Th17细胞数量在造模第三天显著升高，而在肠炎后期Th17细胞数量逐渐降低，这与临床溃疡性结肠炎患者的病理特征不相符，通过在肠炎后期给予艰难梭菌(Clostridiumdifficile)上调小鼠肠道内Th17的数量，可以更好的模拟临床溃疡性结肠炎的病理特征。在第8天给小鼠艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)可以根植。进一步地，所述炎症因子为IL-1β、IL-6或TNF-α。进一步地，所述模型用于构建DSS合并艰难梭菌(Clostridiumdifficile)诱导的急性溃疡性结肠炎模型，慢性反复性发作溃疡性结肠炎模型，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)感染相关的溃疡性结肠炎模型以及结肠炎癌转化模型。所述模型在急慢性溃疡性结肠炎及结肠炎癌转化相关的治疗药物的临床前药学评价中的用途。本专利技术的优先方法如下：步骤一、实验分组与模型建立选5周本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：先让小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)，再通过不同途径给艰难梭菌(Clostridium difficile)，之后进行观察和生化指标测定，当出现小鼠结肠中Th1或Th17的数量增加、结肠组织中IL-17的表达增加和炎症因子的表达上调时，则模型构建成功。/n

【技术特征摘要】
1.一种溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：先让小鼠饮用葡聚糖硫酸钠(DSS)，再通过不同途径给艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，之后进行观察和生化指标测定，当出现小鼠结肠中Th1或Th17的数量增加、结肠组织中IL-17的表达增加和炎症因子的表达上调时，则模型构建成功。


2.根据权利要求1所述的溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：所述小鼠使用雄性小鼠。


3.根据权利要求1所述的溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：所述不同途径为腹腔注射、灌胃或灌肠。


4.根据权利要求1所述的溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：所述途径为灌胃。


5.根据权利要求1所述的溃疡性结肠炎转化动物模型的构建方法，其特征在于：所述先让小鼠饮...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝海平，曹丽娟，黄海，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32