一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺制造技术

本发明专利技术涉及外泌体提取工艺技术领域，提供一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，本发明专利技术用于培养HEK‑293细胞的培养优选为高糖型的DMEM培养基，能够有效的解决HEK‑293细胞在培养过程中贴壁强度比较小的问题，进而使培养基中的HEK‑293细胞于同一个位置生产，便于将HEK‑293细胞分离出来；在培养HEK‑293细胞的过程中，向DMEM培养基中加入了10％的马血清，能够给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，而且马血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进HEK‑293细胞的发育和生长；本发明专利技术在进行差速离心前先对HEK‑293细胞进行步骤S1、S2和S3的处理，能够对细胞内提取的上清液进行浓缩，并在浓缩后对上清液进行收集，从而能够在一定程度上提高提取物中外泌体的纯度，使提取效果更好。

A method of extracting exosomes based on differential centrifugation

【技术实现步骤摘要】
一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺
本专利技术涉及外泌体提取工艺
，具体涉及一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺。
技术介绍
Exosomes，中文名外泌体、外排体、分泌体，是一种能被几乎所有活细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双分子层膜结构。外泌体内包含有大量蛋白质和mRNA、miRNA、IncRNA、dircRNA等非编码RNA，其携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。其功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。其膜表面有CD63、CD81、CD9、TSG101等蛋白质可以作为鉴定外泌体的标志蛋白。外泌体介导的细胞问通讯，主要通过以下三种方式：一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切。剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、nRNA以及microRNA等。由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后，高速离心得到。上述方法提取出的细胞外泌体杂蛋白含量特别高，纯度较低，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以对现有技术的细胞外泌体提取方法进行改进，已经成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
解决的技术问题>针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，解决了现有技术的细胞外泌体提取方法所提取的外泌体纯度较低问题。技术方案为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，包括以下步骤：S1、取HEK-293细胞培养于DMEM培养基中，培养基在使用前加入10％马血清，然后将细胞置于含5％CO2的孵箱内培养，每4-6天传代一次；S2、观察S1中HEK-293细胞生长情况，待细胞融合度达到90％左右弃去原有的培养基，使用PBS缓冲液清洗三遍后，加入DMEM培养基，并将其置于37℃条件下培养24-36h，培养后收集上清液；S3、取100mLS2中的上清液于4℃条件下3000×g离心15-20min，去除死亡细胞，将剩余的上清液移入离心超滤器中，于4℃条件下水平转子4000×g离心浓缩约至1mL；S4、将经过S3处理后的上清液经10000×g离心30-40min，去除细胞碎片和死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留上清液；S5、将S4中的上清液经100000-120000×g离心70-80min，去除上清液留沉淀；S6、向S5中的沉淀内加入1mL1×PBS缓冲液进行冲洗吹打重悬，然后经100000-120000×g离心70-80min，离心后弃干净上清液，所得沉淀即为外泌体；S7、将S6中的外泌体分别在4℃和-80℃的条件下进行短期和长期储存。更进一步地，所述S1中孵箱内的培养温度为37℃，且S1中DMEM培养基选用高糖型。更进一步地，所述S2中DMEM培养基在使用前不加入马血清。更进一步地，所述S2中PBS缓冲液为1×PBS缓冲液。更进一步地，所述S4中离心在4℃的条件下进行。更进一步地，所述S6中在弃干净上清液的过程中，需要除掉吸附在沉淀表面上的杂质。更进一步地，所述S7中在对外泌体进行储存前，先使用纳米颗粒跟踪分析仪来测量外泌体的平均模态尺寸和粒子浓度，再用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度，并对外泌体的平均模态尺寸、粒子浓度和纯度进行标记。有益效果本专利技术提供了一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，与现有公知技术相比，本专利技术的具有如下有益效果：本专利技术培养所选用的细胞为HEK-293细胞，HEK-293细胞极容易转染，扩大培养的速度较快；而且本专利技术用于培养HEK-293细胞的培养优选为高糖型的DMEM培养基，有利于使HEK-293细胞停泊于一个位置进行生长，从而能够有效的解决HEK-293细胞在培养过程中贴壁强度比较小的问题，进而使培养基中的HEK-293细胞于同一个位置生产，便于将HEK-293细胞分离出来；在培养HEK-293细胞的过程中，向DMEM培养基中加入了10％的马血清，能够给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，而且马血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进HEK-293细胞的发育和生长；本专利技术在进行差速离心前先对HEK-293细胞进行步骤S1、S2和S3的处理，能够对细胞内提取的上清液进行浓缩，并在浓缩后对上清液进行收集，从而能够在一定程度上提高提取物中外泌体的纯度，使提取效果更好。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：本实施例的一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，包括以下步骤：S1、取HEK-293细胞培养于DMEM培养基中，培养基在使用前加入10％马血清，然后将细胞置于含5％CO2的孵箱内培养，每4天传代一次；S2、观察S1中HEK-293细胞生长情况，待细胞融合度达到90％左右弃去原有的培养基，使用PBS缓冲液清洗三遍后，加入DMEM培养基，并将其置于37℃条件下培养36h，培养后收集上清液；S3、取100mLS2中的上清液于4℃条件下3000×g离心18min，去除死亡细胞，将剩余的上清液移入离心超滤器中，于4℃条件下水平转子4000×g离心浓缩约至1mL；S4、将经过S3处理后的上清液经10000×g离心40min，去除细胞碎片和死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留上清液；S5、将S4中的上清液经100000×g离心75min，去除上清液留沉淀；S6、向S5中的沉淀内加入1mL1×PBS缓冲液进行冲洗吹打重悬，然后经110000×g离心80min，离心后弃干净上清液，所得沉淀即为外泌体；S7、将S6中的外泌体分别在4℃和-80℃的条件下进行短期和长期储存。更进一步地，S1中孵箱内的培养温度为37℃，且S1中DMEM培养基选用高糖型。更进一步地，S2中DMEM培养基在使用前不加入马血清。更进一步地，S2中PBS缓冲液为1×PBS缓冲液。更进一步地，S4中离心在4℃的条件下进行。更进一步地，S6中在弃干净上清液的过程中，需要除掉吸附在沉淀表面上的杂质。更进一步地，S7中在对外泌体进行储存前，先使用纳米颗粒跟踪分析仪来测量外泌体的平均模态尺寸和粒子浓度，再用颗粒蛋白比测定法表征外泌体纯度，并对外泌体的平均模态尺寸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、取HEK-293细胞培养于DMEM培养基中，培养基在使用前加入10％马血清，然后将细胞置于含5％CO2的孵箱内培养，每4-6天传代一次；/nS2、观察S1中HEK-293细胞生长情况，待细胞融合度达到90％左右时弃去原有的培养基，使用PBS缓冲液清洗三遍后，加入DMEM培养基，并将其置于37℃条件下培养24-36h，培养后收集上清液；/nS3、取100mLS2中的上清液于4℃条件下3000×g离心15-20min，去除死亡细胞，将剩余的上清液移入离心超滤器中，于4℃条件下水平转子4000×g离心浓缩约至1mL；/nS4、将经过S3处理后的上清液经10000×g离心30-40min，去除细胞碎片和死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留上清液；/nS5、将S4中的上清液经100000-120000×g离心70-80min，去除上清液留沉淀；/nS6、向S5中的沉淀内加入1mL1×PBS缓冲液进行冲洗吹打重悬，然后经100000-120000×g离心70-80min，离心后弃干净上清液，所得沉淀即为外泌体；/nS7、将S6中的外泌体分别在4℃和-80℃的条件下进行短期和长期储存。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于差速离心法的细胞外泌体提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取HEK-293细胞培养于DMEM培养基中，培养基在使用前加入10％马血清，然后将细胞置于含5％CO2的孵箱内培养，每4-6天传代一次；
S2、观察S1中HEK-293细胞生长情况，待细胞融合度达到90％左右时弃去原有的培养基，使用PBS缓冲液清洗三遍后，加入DMEM培养基，并将其置于37℃条件下培养24-36h，培养后收集上清液；
S3、取100mLS2中的上清液于4℃条件下3000×g离心15-20min，去除死亡细胞，将剩余的上清液移入离心超滤器中，于4℃条件下水平转子4000×g离心浓缩约至1mL；
S4、将经过S3处理后的上清液经10000×g离心30-40min，去除细胞碎片和死亡细胞的细胞核线粒体等杂质，留上清液；
S5、将S4中的上清液经100000-120000×g离心70-80min，去除上清液留沉淀；
S6、向S5中的沉淀内加入1mL1×PBS缓冲液进行冲洗吹打重悬，然后经100000-120000×g离心70-80min，离心后弃干净上清液，所得沉淀即为外泌体；
S7、将S6中的外泌体分别在4℃和-80℃的...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，
申请(专利权)人：赵凯，
类型：发明
国别省市：山东;37