一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法技术

本发明专利技术公开了一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法，利用青海本地的主栽品种高原448和一个聚合了Sr33、Sr36、Sr42与Sr43四个抗秆锈病小种Ug99基因的种质资源材料Ps4‑1进行杂交，高原448作为轮回亲本回交一次。经与目标基因紧密连锁的分子标记Xcfd15、STM773‑2、FSD‑RSA、Cfa2040对每个世代进行选择，目前获得了大量高抗或者近免疫秆锈病Ug99的高代品系。本发明专利技术涉及分子标记辅助选择、杂交育种以及回交育种。分子标记辅助选择的使用，加快了秆锈病抗病育种的实验进程，减少了育种工作中的选择盲目性，缩短育种年限。

A breeding method of long-term resistance to wheat stem rust Ug99

【技术实现步骤摘要】
一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法
本专利技术属于农业
，涉及一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法。
技术介绍
小麦秆锈病(Pucciniagraminisf.sp.tritici)是全球范围的小麦病害，对小麦破坏性极大，曾在大多数种植小麦的国家和地区出现过毁灭性的灾难(王广金等，2010)。小麦秆锈病主要发生在小麦的叶片基部、叶鞘以及茎秆，严重时穗部颖片也可见明显的菌斑。秆锈病孢子一般是在小麦成熟前三周入侵小麦上述部位，感染1-2d后，在感染部位出现可见失绿斑点，7-15d后，叶片和茎秆原失绿部位出现砖红色夏孢子脓包(宋维富等，2010)。孢子通过气孔进入叶茎组织内部，破坏叶的光合作用面积以及茎的疏导组织，致使有机物合成减少和运输到籽粒受阻，造成小麦减产。秆锈病可使小麦减产高达75％，一些地区甚至绝收。而我国恰好处于小麦秆锈病流行的特定区域内(马勇等，2013)。该病害在我国的常发区和易发区包括东北和西北春麦区，其次为江淮和东南沿海各省的秋播麦区，此外还有西南部分地区，如云南德宏、文山和四川甘孜等(沈阳农学院植保专业植物免疫研究室，1978)。20世纪30-80年代曾在我国爆发过的几次秆锈病造成了几乎毁灭性的减产。抗秆锈病基因Sr31在育种中的广泛应用使得秆锈病在过去的40多年没有大面积爆发(马勇等，2013)。1999年，在非洲中东部乌干达出现的对Sr31有强致病的新致病小种Ug99，再次对小麦的生产产生巨大的威胁(Ghazvini等,2012)。按北美秆锈菌小种命名法则Ug99被命名为TTKS(Pretorius等，2000)，按照现在新的鉴别寄主的体系该命名为TTKSK(Wanyera等，2007)。大量的研究结果表明，TTKSK对几乎所有的亚洲小麦表现为强致病性。当前已知的秆锈病抗性基因中，仅Sr13，Sr14，Sr22，Sr24，Sr28，Sr33，Sr35，Sr36，SrCad，Sr43，Sr45和Sr60等仍对TTKSK保持着抗性(Jin等,2009；Mago等,2009；Purnhauser等,2011；Ghazvini等,2012；Niu等,2014；Chen等,2018)。在生物或非生物条件的帮助下，由于Ug99及其新变异的毒力小种的入侵，超过13个国家遭受着小麦产量严重损失的困扰(Chen等，2018)。到目前为止，已在非洲和中东检测到7种Ug99变种，它们分别是TTKSK(乌干达，肯尼亚，埃塞俄比亚，也门和伊朗)，TTKSF(南非和津巴布韦)，TTKST(肯尼亚)，TTTSK(肯尼亚)，TTKSP(南非)，PTKSK(肯尼亚和埃塞俄比亚)，PTKST(肯尼亚和南非)(Rautela和Dwivedi，2018年)。Sr36长久以来都被认为是一种广泛有效的Sr基因，并且在部分商业小麦品种中投使用。Jin等，(2009)2007年研究发现新的变异小种TTKST和TTTSK分别对Sr24和Sr36具有毒性。Ug99的新突变体以及对携带Sr31和Sr36的小麦品种的毒力表明，具有单一抗性基因的品种在未来不足以应对Ug99中的不断变异。控制杆锈病最经济和持久性措施是用标记辅助选择(MAS)在栽培品种中对多个高效抗性基因进行聚合(Jin等，2007；Rouse等，2012；Rimbaud等，2018；He等，2019)。但到现在还没有人报道同时在育种系中对几个Sr基因进行聚合的工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法。利用标记辅助回交策略并结合表型选择成功地将Sr33，Sr36，SrCad和Sr43基因聚合到高原448中，创建了具有Ug99和条锈病抗性的新的春小麦品系且其在产量和加工品质上也有了很大提升。这些新品系不仅可以在国内用于预防Ug99及其变种，还可以作为育种项目的亲本用于已经患有当前流行病秆锈病的国家和地区。其具体技术方案为：一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法，利用聚合有多个Ug99抗病基因的Ps4-1与高原448杂交并结合表型辅以分子标记选择，从F2代植株中，通过分子标记筛选出含有3-4个Sr基因的单株，用高原448回交。进一步，包括以下步骤：步骤1、PCR扩增以及电泳检测从BC1F2代开始，于每代中筛选株型、分蘖、千粒重、产量等相对较优的单株用4对引物进行Sr基因分子标记鉴定，所述4对引物的序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：8所示，PCR扩增体系(20μL)为：10×Taqbuffer(200mMTris-HCl；200mMKCl；15mMMgCl2)2μL，2.5mMdNTPs1.6μL，2.5U/μLTaqDNApolymerase0.4μL，各引物(除FSD-RSA为FSD12pmol，RSA3.5pmol)正反序列均为5pmol，DNA200ng。PCR程序为：95℃变性4min，然后35个cycles的95℃变性30s，47℃-62℃复性(各引物根据实验前期摸索的最适退火温度确定)30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸10min。不同的PCR产物根据Sr33、Sr36、Sr42的目的条带大小，制作各自的琼脂糖分离胶浓度；然后在TAE缓冲液中，110V电压下，电泳30min；取出后在凝胶成像仪中拍照保存。步骤2、Ug99抗性基因聚合材料抗Ug99鉴定从BC1F5代中随机选择了13份(10％)材料，每份材料各15粒送往加拿大农业部Modern研发中心植物病虫害生物防治实验室(PlantPestContainmentBiocontainmentLab,ModernResearchandDevelopmentCentre,AgricultureandAgri-FoodCanada)进行Ug99抗性鉴定。对秆锈病的抗性分类标准采用6级分类标准，及0、0；、1、2、3和4，并以+和-表示强弱，将0～2+定义为抗病类型，3-～4定义为感病类型(Bariana和Mcintosh，1999)。进一步，步骤1中，针对Sr43的PCR产物设计使用8％聚丙烯酰胺凝胶(PolyacrylamideGe，PAGE)电泳。PAGE胶在1×TBE缓冲液中，160V电压下，电泳2h。将胶置于含EB的1×TBE溶液(10ul：100ml)中浸泡10min，取出在水下冲洗5min，然后在凝胶成像仪中拍照保存。进一步，步骤2中，具体分级标准如下：0(免疫型)：叶片或茎秆上不产生任何可见症状；0；(近免疫型)：叶片或茎秆上生有小型枯死斑，但不形成袍子堆；1(高度抗病型)：叶片或茎秆上产生坏死斑，坏死斑上零星的散生很小的夏孢子堆；2(中度抗病型)：夏孢子堆小到中等，较少，其周围的叶或茎秆组织枯死或者显著失绿；3(中度感病型)：夏孢子堆较大且数量较多，其周围的叶或茎秆组织有褪绿现象；4(高度感病型)：叶片或茎秆不褪绿，上面着生大量夏孢子堆。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术利用青海本地的主栽品种高原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法，其特征在于，利用聚合有多个Ug99抗病基因的Ps4-1与高原448杂交并结合表型辅以分子标记选择，从F

【技术特征摘要】
1.一种长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法，其特征在于，利用聚合有多个Ug99抗病基因的Ps4-1与高原448杂交并结合表型辅以分子标记选择，从F2代植株中，通过分子标记筛选出含有3-4个Sr基因的单株，用高原448回交。


2.根据权利要求1所述的长效抵抗小麦秆锈病Ug99的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、PCR扩增以及电泳检测
从BC1F2代开始，于每代中筛选株型、分蘖、千粒重、产量相对较优的单株用4对引物进行Sr基因分子标记鉴定，所述4对引物的序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：8所示，PCR扩增体系为：10×Taqbuffer：200mMTris-HCl；200mMKCl；15mMMgCl22μL，10×Taqbuffer的成分包含：200mMTris-HCl；200mMKCl；15mMMgCl2，2.5mMdNTPs1.6μL，2.5U/μLTaqDNApolymerase0.4μL，各引物正反序列均为5pmol，DNA200ng；PCR程序为：95℃变性4min，然后35个cycles的95℃变性30s，47℃-62℃复性30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸10min；不同的PCR产物根据Sr33、Sr36、Sr42的目的条带大小，制作各自的琼脂糖分离胶浓度；然后在TAE缓冲液中，110V电压下，电泳30min；取出后在凝胶成像...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，张怀刚，刘韬，刘宝龙，冯承彬，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海;63