一种甲基化检测的方法提供了DNA链中甲基化密度的定量描述。亚硫酸氢盐转化[100]含有甲基化和未甲基化位点的DNA链产生具有错配碱基对的转化DNA链。转化DNA链经PCR扩增[102]，并用固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA磁性标记[104]和杂交[106]单链靶DNA链。杂交期间，可以记录结合信号。增加诸如温度或盐浓度之类的严格条件[108]，以使磁性标记的单链靶DNA链从固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链变性。严格条件增加期间，实时记录产生自变性的磁性标记的单链靶DNA链的变性信号[110]并用于确定甲基化和未甲基化的DNA链的严格条件[112]。DNA链可能还包含野生型基因和突变的基因，因此突变位点可以与甲基化位点同时确定。
Characterization of DNA methylation by magnetoresistive biosensor array
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用磁阻生物传感器阵列表征DNA甲基化专利技术名称专利
本申请总体涉及生物传感技术和装置。更具体地，其涉及生物传感器阵列在DNA甲基化和突变分析中的用途。
技术介绍
癌症是由遗传和表观遗传改变的逐步积累引起的细胞疾病。大规模的测序工作已经确定了能够用作遗传生物标志物的复发性遗传突变，用于评估癌症发生风险，分类疾病亚型，预测对治疗的反应以及监测治疗功效。DNA甲基化引起肿瘤抑制基因的表观遗传沉默，并对其在肿瘤发生中的直接影响及其作为癌症生物标志物的用途进行了研究。在膀胱和结肠癌中，遗传和表观遗传分析的组合已被证明比单独应用两种方法中的任一种具有更高的诊断价值。然而，相较于突变基因分型，甲基化表征(profiling)并不是“是-否”的结果，因为甲基化驱动的基因沉默机制通常对甲基化位点的整体密度敏感，并且基因启动子中通常存在多个CpG二核苷酸(最常见的甲基化位点)。最后，甲基化密度在单一肿瘤内的等位基因和细胞之间可能变化，从而导致异质特征。基于扩增、探针杂交、酶消化、凝胶电泳或测序，已开发出多种技术来检测DNA中的单个单点突变。DNA甲基化信息在聚合酶链反应(PCR)扩增过程中丢失，并且DNA杂交对靶区域的甲基化状态不敏感。因此，必须对DNA进行甲基化敏感的预处理。两种主要的DNA甲基化分析技术基于甲基化敏感性酶消化，亲和富集，其使用对甲基化的胞嘧啶具有特异性的抗体，或亚硫酸氢盐转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶。亚硫酸氢盐转化被最广泛地使用，因为甲基化事件被转化为单碱基改变(C/T)，可以使用源自突变检测的技术进行检测，包括测序阵列杂交、甲基化敏感性PCR和甲基化敏感性解链曲线分析。对亚硫酸氢盐转化的DNA进行测序将定量甲基化状态并允许比较不同测序运行和批次中的数据，但是这既昂贵又耗时。基于扩增和解链的技术对单个甲基化位点不具有特异性，并且不容易扩展以研究大量甲基化位点。基于阵列的方法，诸如IlluminaBeadChip(依诺米那有限公司(IlluminaInc.)，加利福尼亚州圣迭戈)提供了高度多重化的位点特异性试验。然而，在模板的亚硫酸氢盐转化和扩增后，DNA产物主要包含三个碱基(鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶，加上甲基化的胞嘧啶的残基)。这种降低的序列复杂性使得用于终点检测的探针设计变得复杂，并且减少的序列变异降低了特异性。专利技术概述本专利技术旨在可扩展芯片平台中同时进行甲基化(和任选地，突变)表征，所述可扩展芯片平台在紧凑、易于使用且潜在的低成本平台上提供高度特异性和定量的DNA甲基化和突变数据。我们的优选方法基于磁性标记的靶DNA与GMR生物传感器阵列表面栓系的DNA探针的杂交。为了提高DNA杂交试验的特异性，我们采用了表面栓系的DNA杂合体的解链曲线测量。这避免了常规试验条件优化，因为靶标-探针杂合体在解链曲线测量期间暴露于不断增加的严格性。还已经使用荧光和表面等离振子共振测量了表面栓系的DNA探针的解链曲线。相较于这些方法，GMR生物传感器具有很高的灵敏度，几乎没有来自生物样品的磁性背景信号，并且不依赖于温度。一方面，本专利技术提供了一种以单一位点特异性同时表征位点阵列的DNA突变和甲基化事件的方法。它有利地采用以磁阻传感器阵列的甲基化检测，并同时进行DNA序列中甲基化和突变的表征。使用非判别引物扩增基因组(突变)或亚硫酸氢盐处理的(甲基化)DNA，然后将扩增子与磁阻(MR)生物传感器的阵列杂交，然后进行实时解链曲线测量。这种MR生物传感技术提供了可扩展的DNA杂交多重检测，其已被证明对温度、pH值和生物流体基质的变化不敏感。解链曲线法进一步增强了试验特异性和对探针长度变化的耐受性。或者，该技术可以使用在阵列上施加甲基转移酶的方法，以转移拴系在传感器表面的DNA序列上的甲基化位点，并直接靶向甲基化位点进行检测。该方法能够对突变和甲基化位点进行表征并提供与亚硫酸氢焦磷酸测序相当的定量评估甲基化密度。本专利技术的实施方式有利地提供了可以容易地在磁性DNA芯片中实施的表观遗传和突变分析。磁性检测杂交提供了高灵敏度并且几乎没有来自样品和样品基质的磁性背景。靶标-探针杂合体的实时解链曲线测量通过用越来越严格的条件挑战杂合体来提高试验的特异性。增加严格性的方法包括但不限于升高MR生物传感器阵列的温度和降低样品缓冲液中的盐(Na+)浓度。重要的是，实时解链曲线测量消除了终点检测所需的探针优化需求。一方面，一种甲基化检测的方法提供了DNA链中甲基化密度的定量描述。该方法包括对含有甲基化和未甲基化位点的DNA链进行亚硫酸氢盐转化，以产生具有错配碱基对的转化DNA链；对转化DNA链进行PCR扩增以产生PCR扩增的转化DNA链；将PCR扩增的转化DNA链与固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链杂交；在杂交之前或之后，磁性标记PCR扩增的转化DNA链；增加严格条件以使磁性标记的单链靶DNA链由固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链变性；在严格条件增加期间，实时读出变性的磁性标记的单链靶DNA链产生的变性信号；和由变性信号确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件。在一个实施方式中，该方法还包括在磁性标记的单链靶DNA链与固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链杂交期间，实时读出结合信号。严格条件可以是温度，其中增加严格条件包括在盐浓度保持恒定的同时提高温度，并且其中确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件包括确定甲基化和未甲基化DNA链的解链温度。或者，严格条件可以是盐浓度，其中增加严格条件包括在温度保持恒定的情况下降低盐浓度，并且其中确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件包括确定甲基化和未甲基化DNA的解链盐浓度。此外，严格条件可以是温度和盐的组合，其中增加严格性包括同时增加温度和降低盐浓度。在增加严格条件的任何方法中，可以同时检测DNA中的突变位点和甲基化位点。对转化DNA链进行PCR扩增可包括在亚硫酸氢盐转化后和不进行转化的情况下对DNA链进行PCR扩增，其中输入DNA链可以包含甲基化和非甲基化位点和野生型基因和突变基因；并且由变性信号确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件可以包括由变性信号确定甲基化和未甲基化DNA链和野生型基因和突变型基因的严格条件，因此可以同时确定突变位点和甲基化位点。因此，本专利技术提供了一种使用磁阻(MR)传感器阵列的甲基化检测方法。在优选的实施方式中，具有甲基化位点的DNA链经亚硫酸氢盐转化并PCR扩增。然后将它们与具有固定的互补DNA链的温度控制的磁阻(例如GMR)生物传感器阵列杂交并进行磁性标记。通过升高温度使靶DNA链由固定的DNA链变性。将来自靶DNA的结合信号的实时测量用于确定解链曲线。在另一个实施方式中，使用盐浓度而不是温度来使靶DNA链变性。该技术可与同一生物传感器芯片上的基因突变测量结合使用。另一方面，一种甲基化检测的方法提供了DNA序列中甲基化密度的定量描述。该方法包括对具有或不具有甲基化位点的DNA链进行亚硫酸氢盐转化；PCR扩增转化DNA链；转化的靶DNA链与固定有(未甲基化)互补DNA链的MR传感器阵列杂交；添加甲基转移酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甲基化检测的方法，所述方法提供了DNA链中甲基化密度的定量描述，所述方法包括：/n对含有甲基化和未甲基化位点的DNA链进行亚硫酸氢盐转化，以产生具有错配碱基对的转化DNA链；/n对所述转化DNA链进行PCR扩增，以产生PCR扩增的转化DNA链；/n磁性标记所述PCR扩增的转化DNA链；/n使PCR扩增的转化DNA链与固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链杂交，其中所述杂交在磁性标记之前或之后进行；/n增加严格条件，以使所述磁性标记的单链靶DNA链由固定于磁阻(MR)传感器阵列上的所述互补DNA链变性；/n增加所述严格条件期间，实时读出产生自变性磁性标记的单链靶DNA链的变性信号；/n由所述变性信号确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170501 US 62/492,6171.一种甲基化检测的方法，所述方法提供了DNA链中甲基化密度的定量描述，所述方法包括：
对含有甲基化和未甲基化位点的DNA链进行亚硫酸氢盐转化，以产生具有错配碱基对的转化DNA链；
对所述转化DNA链进行PCR扩增，以产生PCR扩增的转化DNA链；
磁性标记所述PCR扩增的转化DNA链；
使PCR扩增的转化DNA链与固定于磁阻(MR)传感器阵列上的互补DNA链杂交，其中所述杂交在磁性标记之前或之后进行；
增加严格条件，以使所述磁性标记的单链靶DNA链由固定于磁阻(MR)传感器阵列上的所述互补DNA链变性；
增加所述严格条件期间，实时读出产生自变性磁性标记的单链靶DNA链的变性信号；
由所述变性信号确定甲基化和未甲基化DNA链的严格条件。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括在所述磁性标记的单链靶DNA链与固定于磁阻(MR)传感器阵列上的所述互补DNA链杂交期间，实时读出结合信号。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述严格条件是温度，其中增加所述严格条件包括在盐浓度保持恒定的同时提高所述温度，并且其中确定所述甲基化和未甲基化DNA链的严格条件包括确定所述甲基化和未甲基化DNA链的解链温度。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述严格条...
【专利技术属性】
技术研发人员：李政録，S·X·王，M·F·汉森，M·杜伏威，G·利兹，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，丹麦技术大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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