检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法技术

本发明专利技术提供了检测血液中利培酮及9‑羟基利培酮的方法包括：制备利培酮及9‑羟基利培酮标准储备液、制备利培酮及9‑羟基利培酮标准中间液、制备内标工作液和制备标准溶液，利用液相色谱‑质谱联用仪检测标准溶液，拟合得到利培酮及9‑羟基利培酮对应的标准曲线方程分别为：y

A method for the determination of risperidone and 9-hydroxyrisperidone in blood

【技术实现步骤摘要】
检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法。
技术介绍
利培酮为苯并异恶唑衍生物，属第二代抗精神病药，用于治疗急性和慢性精神分裂症。特别是对阳性及阴性症状及其伴发的情感症状(如焦虑、抑郁等)有较好的疗效。也可减轻与精神分裂症有关的情感症状。9-羟基利培酮是利培酮的主要活性代谢产物，与利培酮有相似的药理作用，两者共同构成抗精神病的活性成分，故对利培酮及其活性代谢产物的监测具有重要的临床意义。目前，检测服用利培酮的患者的血液样本时，通常采用高相液相色谱法进行测试。但是，通过上述方法检测血液样本中的利培酮和其活性代谢物9-羟基利培酮含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，能够提高血液样本的检测效率。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定(a)制备利培酮和9-羟基利培酮标准储备液精确称取利培酮标准品2.38mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；精确称取9-羟基利培酮标准品1.87mg置于10mL容量瓶，用含水量为30％-80％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到9-羟基利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；(b)制备利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液将上述步骤(a)的利培酮标准储备液和9-羟基利培酮标准储备液分别用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释成10mg/L的标准过渡中间液，再按照1∶1的体积混合，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述利培酮和9-羟基利培酮的标准过渡中间液，制成含有浓度为5ng/mL～1000ng/mL的利培酮和浓度为5ng/mL～1000ng/mL的9-羟基利培酮的至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮标准中间液，并在-80℃条件下保存；(c)制备内标工作液将100mg/L的利培酮-d4储备液和1000mg/L的9-羟基利培酮-d4储备液按照10∶1的体积混合，得到混合液，上述混合液中所含的利培酮-d4储备液和9-羟基利培酮-d4储备液的浓度相同，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有50～250ng/mL利培酮-d4和含有50～250ng/mL9-羟基利培酮-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；(d)制备标准溶液分别移取10μL上述至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液，在上述每一种利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；(e)拟合标准曲线方程利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的利培酮和利培酮-d4、9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的利培酮的色谱峰峰面积与利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，9-羟基利培酮的色谱峰峰面积与9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的利培酮的浓度与利培酮-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，9-羟基利培酮的浓度与9-羟基利培酮-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x2，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到利培酮和利培酮-d4对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4对应的标准曲线方程为：y2＝c*x2+d，并且得到权重系数a、b、c、d；(二)待测血液样本的处理取待测血液至少2mL，在离心速度3000～4000rpm下离心8～15min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；移取步骤(c)的利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min，然后在上述离心管中加入蛋白沉淀剂乙腈300μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min得到上清液，得到上清液即为待测血液样本；(三)待测血液样本的检测利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的利培酮和利培酮-d4、9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的利培酮的色谱峰峰面积与利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的利培酮兰的浓度与利培酮-d4的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，利培酮-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的利培酮浓度；将待测血液样本中的9-羟基利培酮的色谱峰峰面积与9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为y2，代入步骤(e)得到的y2＝c*x2+d公式中，计算得到待测血液样本中的9-羟基利培酮的浓度与9-羟基利培酮-d4的浓度的比值x2，由于上述待测血液样本中，9-羟基利培酮-d4的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的9-羟基利培酮浓度。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液，它们分别是含有5ng/mL利培酮和5ng/mL9-羟基利培酮、10ng/mL利培酮和10ng/mL9-羟基利培酮、50ng/mL利培酮和50ng/mL9-羟基利培酮、100ng/mL利培酮和100ng/mL9-羟基利培酮、250ng/mL利培酮和250ng/mL9-羟基利培酮、500ng/mL利培酮和500ng/mL9-羟基利培酮和1000ng/mL利培酮和1000ng/mL9-羟基利培酮的标准中间液。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：在步骤(b)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：在步骤(a)中，用纯甲醇溶解利培酮标准品，用含水量50％是甲醇溶液溶解9-羟基利培酮标准品。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：在步骤(c)中，用含水量为30％甲醇稀释液稀释利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4储备液，得到一种含有100ng/mL利培酮-d4和含有100ng/mL9-羟基利培酮-d4的内标工作液。本专利技术的检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C18反向色谱柱；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其特征在于：它包括以下步骤：/n(一)标准溶液的标定/n(a)制备利培酮和9-羟基利培酮标准储备液/n精确称取利培酮标准品2.38mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；/n精确称取9-羟基利培酮标准品1.87mg置于10mL容量瓶，用含水量为30％-80％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到9-羟基利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；/n(b)制备利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液/n将上述步骤(a)的利培酮标准储备液和9-羟基利培酮标准储备液分别用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释成10mg/L的标准过渡中间液，再按照1∶1的体积混合，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述利培酮和9-羟基利培酮的标准过渡中间液，制成含有浓度为5ng/mL～1000ng/mL的利培酮和浓度为5ng/mL～1000ng/mL的9-羟基利培酮的至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮标准中间液，并在-80℃条件下保存；/n(c)制备内标工作液/n将100mg/L的利培酮d4储备液和1000mg/L的9-羟基利培酮d4储备液按照10∶1的体积混合，得到混合液，上述混合液中所含的利培酮-d4储备液和9-羟基利培酮-d4储备液的浓度相同，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有50～250ng/mL利培酮-d4和含有50～250ng/mL 9-羟基利培酮-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；/n(d)制备标准溶液/n分别移取10μL上述至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液，在上述每一种利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；/n(e)拟合标准曲线方程/n利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的利培酮和利培酮-d4、9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的利培酮的色谱峰峰面积与利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y...

【技术特征摘要】
1.一种检测血液中利培酮和9-羟基利培酮的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备利培酮和9-羟基利培酮标准储备液
精确称取利培酮标准品2.38mg置于2mL冻存管，用含水量为0％-30％的甲醇溶液进行溶解，并定容于1mL，得到利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；
精确称取9-羟基利培酮标准品1.87mg置于10mL容量瓶，用含水量为30％-80％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到9-羟基利培酮标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液
将上述步骤(a)的利培酮标准储备液和9-羟基利培酮标准储备液分别用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释成10mg/L的标准过渡中间液，再按照1∶1的体积混合，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述利培酮和9-羟基利培酮的标准过渡中间液，制成含有浓度为5ng/mL～1000ng/mL的利培酮和浓度为5ng/mL～1000ng/mL的9-羟基利培酮的至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
将100mg/L的利培酮d4储备液和1000mg/L的9-羟基利培酮d4储备液按照10∶1的体积混合，得到混合液，上述混合液中所含的利培酮-d4储备液和9-羟基利培酮-d4储备液的浓度相同，用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述混合液，得到一种含有50～250ng/mL利培酮-d4和含有50～250ng/mL9-羟基利培酮-d4的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液，在上述每一种利培酮和9-羟基利培酮的标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为70％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的利培酮和利培酮-d4、9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的利培酮的色谱峰峰面积与利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，9-羟基利培酮的色谱峰峰面积与9-羟基利培酮-d4的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的利培酮的浓度与利培酮-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，9-羟基利培酮的浓度与9-羟基利培酮-d4的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x2，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到利培酮和利培酮-d4对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，9-羟基利培酮和9-羟基利培酮-d4对应的标准曲线方程为：y2＝c*x2+d，并且得到权重系数a、b、c、d；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3000～4000rpm下离心8～15min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的利培酮-d4和9-羟基利培酮-d4的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在2500rpm的转速下涡旋震荡混合1min，然后在上述离心管中加入蛋白沉淀剂乙腈300μL，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：雒琴，贾永娟，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11