一种循环miR-1290的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种循环miR‑1290的检测方法，包含以下步骤：(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。本发明专利技术成本相对较低，而灵敏度和特异性较好。可用于人和动物等相关的基础和应用研究工作。

A detection method of cyclic mir-1290

【技术实现步骤摘要】
一种循环miR-1290的检测方法
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种循环miR-1290的检测方法。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类长约19-23个核苷酸的非编码单链小RNA，广泛存在于各种生物体内，是一类重要的调控因子。miRNA通过与靶mRNA的互补配对，降解靶mRNA或抑制翻译，从而在转录后水平上对基因表达进行调控。miRNA具有高度保守性和严格的时空特异性，与其靶mRNA分子组成了复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生命活动。miRNA在肿瘤的发生中起重要作用。研究表明，miRNA可以稳定地存在于血清和血浆等多种体液中，这种miRNA被称为循环miRNA，与肿瘤的发生发展密切相关，可作为肿瘤筛查、高风险人群预测及治疗效果评估的重要标志物。循环miRNA主要来源于两种途径：组织损伤或凋亡坏死细胞的被动渗漏和源自细胞的微囊泡的主动分泌。循环miRNA虽独立于细胞而存在，但是具有较高的稳定性，可能是由于RNA与DNA退火，从而既能耐受DNase又能耐受RNase降解，或者RNA被包入脂质或脂蛋白复合物内而收到保护，或者通过化学修饰或与蛋白结合而受到保护。目前miRNA的检测方法主要有Northernblot分析、实时荧光定量PCR检测(real-timeqPCR)、DNA微阵列芯片和二代测序等。Northernblot分析方法简单易行，但灵敏度低、耗时长，重复性差且需要的总RNA量较大，不适合用于循环miRNA的检测。微阵列芯片可以进行高通量的miRNA分析，但仍需足够的初始样本量，灵敏度亦不高。二代测序技术同样可以实现miRNA的高通量检测，但检测成本较高，不适于临床大样本分析。qPCR检测通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累来实时监测整个PCR进程，进而实现对起始未知含量模板的定量和定性分析。相比于Northernblot和微阵列分析，qPCR需要的样本量较少，并且显著提高了检测范围和灵敏度。但由于miRNA非常小，需要特殊设计的引物来实现PCR检测。目前主要有两种方式：poly(A)加尾法和茎环法。poly(A)加尾法利用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly(A)序列，然后利用Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录引物的通用性，降低了检测成本，但同时也降低了检测的灵敏性和特异性。茎环法通过茎环状引物对miRNA进行逆转录，由于该茎环状引物的5’端含有一个茎环结构，而3’端具有6个与成熟miRNA3’端配对的特异性碱基，可以将短的成熟miRNA分子扩展并增加一个特异的3’引物位点，从而可以特异性的进行逆转录反应。循环miRNA检测为液体活检的重要内容，对肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后监测具有重要价值。Imaoka等研究(AnnalsofOncology27:1879–1886,2016)指出结直肠腺癌患者血清miR-1290显著升高，循环miR-1290可作为独立的预后因素。AngLi等研究(ClinCancerRes；19(13)JμLy1,2013)发现miR-1290在胰腺癌血清中显著升高，胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和胰腺神经内分泌肿瘤患者的受试者工作曲线(ROC)面积分别为0.96，0.81和0.80，循环miR-1290可作为胰腺癌早期诊断标志物。FrancescaTavano等研究(SciRep；8(1)Nov6,2018)发现血浆miR-1290与CA19-9联合检测较两者分别单独检测，具有更强的诊断和鉴别效能。因此循环miR-1290是一个潜在的肿瘤标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种循环miR-1290的检测方法，其是一种结合茎环法逆转录与taqman探针法实时荧光定量PCR对循环miR-1290进行定量的检测方法。所采用的技术方案为：一种循环miR-1290的检测方法，包含以下步骤：(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。进一步地，步骤(1)中，提取循环miRNA是通过核酸吸附柱来实现的。进一步地，步骤(2)中，逆转录体系包括逆转录缓冲液、逆转录酶、逆转录引物、无核酸酶纯水和miRNA模板；逆转录引物含有用于精确区分高度同源的miRNA的特异性茎环结构；针对所述miR-1290的逆转录引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；逆转录的反应条件为：16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。进一步地，逆转录体系总体积为20μL，其中，逆转录缓冲液10μL、逆转录酶1.5μL、逆转录引物1μL、无核酸酶纯水稀释的miRNA模板7.5μL。进一步地，步骤(3)中，qPCR检测的反应体系包括：Taqman预混液、特异性正向引物、通用反向引物、Taqman探针，无核酸酶纯水和cDNA模板；针对所述miR-1290的特异性正向引物、Taqman探针和通用反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.10所示；qPCR检测的反应条件为：95℃预变性2.5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min。进一步地，qPCR检测的反应体系总体积为10μL，其中，Taqman预混液5μL、特异性正向引物(10mM)0.2μL、通用反向引物(10mM)0.2μL、Taqman探针(10mM)0.4μL，无核酸酶纯水稀释的cDNA模板4.2μL。进一步地，步骤(1)中，添加内参体系，内参体系包含：内参miR-16-5p和cel-miR-39以及相应的逆转录引物、qPCR正向引物和Taqman探针，miR-16-5p的逆转录引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4，miR-16-5p的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，miR-16-5p的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，cel-miR-39的逆转录引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，cel-miR-39的qPCR正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示，cel-miR-39的Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示；miR-16-5p的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示；cel-miR-39的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示。进一步地，所述内参cel-miR-39是在样本提取过程中加入的体积为2μL的内参cel-miR-39溶液，浓度为0.2uM。一种试剂盒，其是用上述任一方案所述的循环miR-1290的检测方法制备成miR-1290分析试剂盒。一种应用，其是用上述任一方案所述的循环miR-1290的检测方法，进行血清或血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环miR-1290的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：/n(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；/n(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；/n(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种循环miR-1290的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)从检测样本血浆或血清中提取循环miRNA；
(2)茎环法逆转录：将步骤(1)中得到的miRNA进行特异性茎环法逆转录；
(3)qPCR检测：以步骤(2)中所获得的cDNA为模板，进行qPCR检测。


2.根据权利要求1所述的循环miR-1290的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，提取循环miRNA是通过核酸吸附柱来实现的。


3.根据权利要求1所述的循环miR-1290的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，逆转录体系包括逆转录缓冲液、逆转录酶、逆转录引物、无核酸酶纯水和miRNA模板；逆转录引物含有用于精确区分高度同源的miRNA的特异性茎环结构；针对所述miR-1290的逆转录引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；逆转录的反应条件为：16℃温浴30min，37℃温浴30min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存。


4.根据权利要求3所述的循环miR-1290的检测方法，其特征在于，逆转录体系总体积为20μL，其中，逆转录缓冲液10μL、逆转录酶1.5μL、逆转录引物1μL、无核酸酶纯水稀释的miRNA模板7.5μL。


5.根据权利要求1所述的循环miR-1290的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，qPCR检测的反应体系包括：Taqman预混液、特异性正向引物、通用反向引物、Taqman探针，无核酸酶纯水和cDNA模板；针对所述miR-1290的特异性正向引物、Taqman探针和通用反向引物的核苷酸序列分别如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.10所示；qPCR检测的反应条件为：95℃预变性2.5min，95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸10min。


6.根据权利要求5所...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡建庭，徐丽怡，朱永良，陈肖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33