一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，本专利将筛选获得的噬菌体根据其对不同人畜共患病原菌的裂解效果，形成不同人畜共患病原菌的噬菌体库，并根据噬菌体库设计制备一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，该检测板包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒，利用本专利可构建高通量噬菌体筛选体系，形成一套完整的标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合、信息可上传兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库的筛选体系。

A high-throughput physical examination plate for screening human and animal pathogens and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用
本专利技术涉及一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，属于微生物领域。
技术介绍
细菌感染和污染是我国乃至全球的经济和健康问题。抗生素近半个世纪的广泛应用，导致人畜共患病原菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、链球菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌等普遍存在多重抗药性，噬菌体防治细菌感染和防止细菌污染具有巨大的应用潜力，成为当代医疗和畜产品生产的迫切需要。噬菌体是细菌的特异性病毒，具有种甚至菌株的高度特异性，而兽医临床流行菌株又是变异和流动的，群体小动物饲养流行菌株往往形成异质的流行菌群，因此①需要高效动态获得大范围流行菌株；②筛选相应的噬菌体，逐步建立某种细菌的菌株库和噬菌体库(均为几百株的规模)，这样，③面对某一菌株或者菌群，从噬菌体库中高效筛选相应的裂解性噬菌体，才能获得最佳的防治效果。传统的点滴法筛选噬菌体的检测产品，存在通量小、成本高、耗时、费力、裸眼不能准确识别和统计等缺点。因此，需要建立一种标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合的筛选体系，按照裂解率排序优选，根据各株噬菌体的裂解谱的互补性进行组合优化，以最少种类的噬菌体裂解最多种类的细菌
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用，本专利将筛选获得的噬菌体根据其对不同人畜共患病原菌的裂解效果，形成不同人畜共患病原菌的噬菌体库，并根据噬菌体库设计制备一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板。一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒；所述A噬菌体盒包括噬菌体液或噬菌体冻干粉(使用时加生理盐水稀释悬浮)、第一孔板和第一不带接种针的盖板；所述B接种盒包括第二孔板和带接种针的盖板，所述的带接种针的盖板上的接种针和带孔噬菌体板上的孔洞一一对应；所述C检测盒包括菌种检测板和第二不带接种针的盖板。进一步的，上述第一孔板和第二孔板为96孔板。进一步的，上述噬菌体液放置于第一孔板的孔洞中，每个孔洞放置一种噬菌体液。进一步的，上述菌种检测板不带孔洞。进一步的，上述人畜共患病原菌优选为但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中的一种。进一步的，上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的制备方法包括如下步骤：1)人畜共患病原菌菌液的制备：划线平板法培养一种人畜共患病原菌，挑取单菌落接种于液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养6-10h，检测菌种生长情况，菌种到达指数生长期即可；2)获得上述人畜共患病原菌的噬菌体：取步骤1)中获得的人畜共患病原菌的菌种液，人畜共患病原菌的噬菌体，利用双层琼脂法制备含有人畜共患病原菌的菌种液及其噬菌体的平板培养基，35-37℃培养3-6h，挑取平板上透明清晰单个噬菌斑至SM缓冲液中，3-4℃过夜，滤膜过滤，获得噬菌体；3)富集噬菌体：取80-100μl的步骤2)中获得的噬菌体和80-100μl步骤1)中获得的人畜共患病原菌菌液混合后加入液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养10-12h，获得富集的噬菌体培养液，将上述噬菌体培养液离心后滤膜过滤，获得富集的噬菌体液；4)制备人畜共患病原菌噬菌体检测板：将该种人畜共患菌所有的噬菌体按照上述步骤1)-步骤3)的方法制备其富集的噬菌体液，标号，依次注入带孔噬菌体板中，盖上第一不带接种针的盖板，放置于超净工作台，获得A噬菌体盒；准备和第一孔板类似的第二孔板，灭菌后盖上带有接种针的盖板，放置于超净工作台，获得B检测盒；另准备尺寸和第一孔板类似但不带孔洞的菌种检测板，灭菌后盖上不带有接种针的盖板，放置于超净工作台，获得C检测盒；即可获得高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板。进一步的，上述培养基指LB培养基。进一步的，上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的使用方法包括如下步骤：1)取出上述制备好的筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，用排枪或者移液工作站在装有噬菌体液的A盒第一孔板的每孔中都加入80-90μl的生理盐水，并震荡混匀2分钟；2)高压灭菌固体培养基倾倒于上述C检测盒中的菌种检测板上，待凝固后，加入添加有待检人畜共患病原菌菌液的半固体培养基，做成人畜共患病原菌的双层琼脂检测板；3)用B检测盒的带接种针的盖板蘸取第一孔板中噬菌体液，对准接种到步骤2)获得的人畜共患病原菌的双层琼脂检测板上，盖上第二不带接种针的盖板，倒置35-37℃培养5-6h；4)用图像自动识别仪拍照步骤3)中接种了噬菌体的的菌种检测板，定位识别每个孔对应位置有无噬菌斑，并记录其对应的噬菌体编号，录入兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库；5)统计分析：对于每一株人畜共患病原菌统计裂解性噬菌体；对于每一株噬菌体统计其对该待检菌群的裂解率，从高到低排序；根据每一株噬菌体对该种人畜共患病原菌的裂解谱互补性，选择能裂解最多人畜共患病原菌的最少株噬菌体组合。上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在筛选人畜共患病原菌的噬菌体中的应用。上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在构建人畜共患病原菌的噬菌体库中的应用。上述高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板在针对待检菌群从噬菌体库中高效筛选裂解性噬菌体中的应用。有益效果：(1)实现人畜共患病原体的噬菌体筛选的高通量性。传统的点滴法筛选噬菌体单次筛选量小，且总体筛选过程成本高、耗时、费力，本专利技术的筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板可以单次筛选多个裂解性噬菌体，并根据每一株噬菌体对该种病原菌的裂解谱互补性，选择能裂解最多株该病原菌的最少株噬菌体组合。(2)本专利可应用于构建高通量噬菌体筛选体系，形成一套完整的标准化操作、高通量检测、自动化识别并转化为统计数据智能化组合、信息可上传兽医抗药性云监测与噬菌体防控(Varms)数据库的筛选体系。附图说明图1沙门氏菌在培养基上的形态。图2形成的检测板产品照片。图3点阵沙门氏菌噬菌体检测板上的噬菌斑图。图4噬菌体裂解不同菌种的情况。具体实施方式为了使本
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1制备96点阵沙门氏菌噬菌体检测深孔板一、材料和方法①沙门氏菌培养：在LB琼脂培养基划线接种沙门氏菌，37℃恒温培养12h。挑取单菌落，置于装有1ml的LB液体培养基的灭菌管中，37℃，180r/min震荡培养6h，待液体浑浊，菌液到达指数期即可。②双层平板活化噬菌体：取无菌5mlEP管，加入100μl培养好的沙门氏菌液，同时也加入对应的已稀释到合适梯度的沙门氏菌噬菌体100μl，随后加入事本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，其特征在于，包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒；/n所述A噬菌体盒包括噬菌体液或噬菌体冻干粉(使用时加生理盐水稀释悬浮)、第一孔板和第一不带接种针的盖板；/n所述B接种盒包括第二孔板和带接种针的盖板，所述的带接种针的盖板上的接种针和带孔噬菌体板上的孔洞一一对应；/n所述C检测盒包括菌种检测板和第二不带接种针的盖板。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板，其特征在于，包括A噬菌体盒、B接种盒和C检测盒；
所述A噬菌体盒包括噬菌体液或噬菌体冻干粉(使用时加生理盐水稀释悬浮)、第一孔板和第一不带接种针的盖板；
所述B接种盒包括第二孔板和带接种针的盖板，所述的带接种针的盖板上的接种针和带孔噬菌体板上的孔洞一一对应；
所述C检测盒包括菌种检测板和第二不带接种针的盖板。


2.如权利要求1所述的检测板，其特征在于，所述第一孔板和第二孔板为96孔板。


3.如权利要求1所述的检测板，其特征在于，所述的噬菌体液或噬菌体冻干粉放置于带孔噬菌体板上的孔洞中，每个孔洞放置一种噬菌体液。


4.如权利要求1所述的检测板，其特征在于，所述的菌种检测板不带孔洞。


5.如权利要求1所述的检测板，其特征在于，所述的人畜共患病原菌为大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中的一种。


6.如权利要求1所述的高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)人畜共患病原菌菌液的制备：划线平板法培养一种人畜共患病原菌，挑取单菌落接种于液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养6-10h，检测菌种生长情况，菌种到达指数生长期即可；
2)获得上述人畜共患病原菌的噬菌体：取步骤1)中获得的人畜共患病原菌的菌种液，人畜共患病原菌的噬菌体，利用双层琼脂法制备含有人畜共患病原菌的菌种液及其噬菌体的平板培养基，35-37℃培养3-6h，挑取平板上透明清晰单个噬菌斑至SM缓冲液中，3-4℃过夜，滤膜过滤，获得噬菌体；
3)富集噬菌体：取80-100μl的步骤2)中获得的噬菌体和80-100μl步骤1)中获得的人畜共患病原菌菌液混合后加入液体培养基中，36-38℃，150-180r/min震荡培养10-12h，获得富集的噬菌体培养液，将上述噬菌体培养液离心后滤膜过滤，获得富集的噬菌体液；
4)制备人畜共患病原菌噬菌体检测板：将该种人畜共患菌所有的噬菌体按照上述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉庆，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，瑞科盟青岛生物工程有限公司，刘玉庆，
类型：发明
国别省市：山东;37