本发明专利技术的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因及其编码蛋白。本发明专利技术的第二个目的在于提供含有所述卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因的表达载体及利用该载体转化的重组菌株。本发明专利技术的第三个目的在于提供一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin蛋白的方法。本发明专利技术的第四个目的在于提供所述卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因的应用。
NK lysin gene and its application
【技术实现步骤摘要】
一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用。
技术介绍
抗菌肽(AntimicrobialPeptides，AMPs)是一种基因编码，核糖体合成的小于10kDa，具有总净正电荷的小分子多肽。AMPs是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分，在免疫方面发挥重要作用。近年来，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外饲料科学和药理学的研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域具有广阔的应用前景。目前，在鱼类中已经发现80多种抗菌肽，其中NK-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(SALIP)家族的成员，首次在猪毒性淋巴细胞中发现，是由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞产生抗微生物阳离子蛋白，并储存在溶细胞颗粒中，具有广谱抗菌性。NK-lysin具有保守的鞘脂激活蛋白B结构域和六个半胱氨酸，六个半胱氨酸形成三个分子内二硫键，可通过其螺旋结构在细胞膜中形成孔，使得微生物的脂质双层膜以非特异性方式渗透。在大黄鱼、大菱鲆、罗非鱼等硬骨鱼类研究表明，NK-lysin不仅对细菌、真菌具有抗菌活性，对病毒和寄生虫同样也具有生物活性。卵形鲳鲹(TrachinotusOvatus)具有生长速度快，经济价值高，适合网箱养殖等优点，已成为我国南方池塘和网箱养殖的主要品种，养殖年产量已超过10万吨。然而，随着卵形鲳鲹养殖产业发展，再加上养殖环境日益恶化，卵形鲳鲹养殖病害频发，常引起较高死亡率，严重制约了卵形鲳鲹养殖产业的可持续发展。传统养殖过程中多采用抗生素进行治疗，但长期使用抗生素不但污染养殖环境，同时还会导致病原体产生抗药性。因此，开发一种安全、高效的抗菌剂尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及其编码蛋白。本专利技术的第二个目的在于提供含有所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体及利用该载体转化的重组菌株。本专利技术的第三个目的在于提供一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的方法。本专利技术的第四个目的在于提供所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的应用。本专利技术的第一个目的通过以下技术方案实现：一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。如SEQIDNO.3所示为卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA，其全长是通过卵形鲳鲹转录组测序和基因组测序结果综合检索分析获得。上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。表达上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白的抗菌肽成熟肽的基因序列是以卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的全长双链cDNA为模板，经PCR方法扩增获得，它来源于卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的成熟肽区域所对应的的基因片段，其为所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA序列210bp至506bp(相当于第50至第147位氨基酸)的片段。上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白的氨基酸序列分析表明，卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin由147个氨基酸残基组成，其中前49个氨基残基为信号肽序列，后98个氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽是由抗菌肽切除信号肽形成的，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌均具有抑菌活性。革兰氏阴性菌包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、大肠杆菌、美人鱼发光杆菌等；革兰氏阳性菌包括无乳链球菌、金黄葡萄球菌和芽孢杆菌等。本专利技术的第二个目的通过以下技术方案实现：包含上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体。本专利技术所述的表达载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的表达载体的相应酶切位点(即EcoRI和HindⅢ)之间，即构建含有卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体。上述包含卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体优选由卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因与大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1构建成的重组表达载体，命名为PGEX-6P-1/mNK-lysin。本专利技术还包括由上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化的重组菌株。利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因。其中所述的寄主细胞优选为大肠杆菌。该重组微生物由含有卵形鲳鲹NK-lysin基因的大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1/mNK-lysin转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21。本专利技术的第三个目的通过以下技术方案实现：一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的方法，利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到重组菌株，再将重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白。其具体过程如下：选取大肠杆菌重组菌株PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21接种在10mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于相同的培养基中，当重组菌生长进入对数期时，加100mMIPTG至最终浓度为0.1mM，220rpm振荡培养，当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。本专利技术的第四个目的通过以下技术方案实现：所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术编码了卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA的核苷酸序列，并将该基因构建重组表达载体和该表达载体重组菌株，利用该重组菌株获得大量表达的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白，该重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白能进一步应用于制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的卵形鲳鲹等海水鱼类抗菌剂或杀菌剂，有效解决目前卵形鲳鲹养殖过程中的病害问题。附图说明以下通过附图对本专利技术作进一步的说明。图1卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin成熟肽基因的合成PCR扩增产物电泳图。图2经诱导的卵形鲳鲹PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21的SDS-PAGE凝胶电泳图(依次为蛋白Maker，pGEX-6P-1，全菌，上清，沉淀；B纯化的蛋白)。图3GST抗体的免疫印迹结果图。图4纯化的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。图5重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白活性检测结果图(A溶藻弧菌，B鳗弧菌，C无乳链球菌，D芽孢杆菌)。具体实施方式以下通过具体的实施例对本专利技术作进一步的说明。...
【技术保护点】
1.一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.一种包含权利要求1所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因。
5.权利要求4所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述菌株由权利要求3所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，形成含有卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的重组菌株。
6.如权利要求5所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述的寄主细胞为...
【专利技术属性】
技术研发人员：张殿昌，刘广东，郭华阳，朱克诚，郭梁，刘宝锁，张楠，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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