一种微生物发酵提取杨梅素的方法技术

本发明专利技术属于天然产物分离技术领域，涉及一种微生物发酵提取杨梅素的方法。所述方法包括以下步骤：1)制备含有黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液的共固定化凝胶珠；2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1‑5次，滤液合并并浓缩，滤渣干燥；3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5‑4/5干燥滤渣，40‑50℃下发酵提取140‑170h；4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1‑5次，合并滤液浓缩，得沉淀物；6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。该提取方法大大提高杨梅素收率和纯度，并且绿色环保安全。

A method of extracting myricetin by microbial fermentation

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵提取杨梅素的方法
本专利技术属于天然产物分离
，涉及一种微生物发酵提取杨梅素的方法。
技术介绍
杨梅素[3，5，7-三羟基-2-(3，4，5-三羟基苯基)-4H-1-苯并呋喃-4-酮，Myricetin]又名杨梅树皮素、杨梅黄酮、杨梅酮、杨梅黄素，是一种多羟基黄酮醇化合物，黄色针状结晶，熔点为324.0～325.5℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，微溶于水，难溶于氯仿、石油醚。现代药理学研究表明，杨梅素具有抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、保肝和抗氧化等多种药理活性，尤其在防治心血管疾病方面作用明显。鉴于其优异的抗氧化功能及降低胆固醇等作用，从植物中提取杨梅素已成为研究热点。杨梅素广泛分布于杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科和大戟科等多科植物中，而其中以杨梅科和葡萄科植物为代表植物。我国的杨梅资源非常丰富，其中非果部位(枝、叶、皮)目前几乎处于闲置和荒废状态，从杨梅植物非果部分中提取杨梅素，对这些非果部分进行有效利用具有良好的生态及经济价值。杨梅素存在于细胞内含物中，提取方法一般是利用酒精良好的穿透性，将其溶出细胞外。如邓丹雯等人(邓丹雯，杨佩，吕建壵，等.杨梅素提取工艺优化[J].食品与发酵工业，2013(3))研究的利用乙醇从杨梅枝中提取杨梅素的工艺，最佳提取工艺为提取温度84.86℃、乙醇体积分数82.09％、液料比为12.82∶1、提取时间1.5h，在此条件下，杨梅素的提取得率依旧非常低，仅为1.355％。这是因为杨梅枝等植物中存在大量的纤维，细胞壁也是由木质素、纤维素及果胶等成分构成，它们都会影响杨梅素的溶出率，进而降低杨梅素的提取效率；而且杨梅素多以杨梅苷的形式存在于天然植物中，单纯的乙醇提取，并不能将植物中杨梅苷转换为杨梅素，故而杨梅素提取率低。中国专利申请(公开号CN107721963A)公开了一种从杨梅树皮中提取分离杨梅素的方法，利用盐酸、硫酸或者硝酸将提取到的杨梅苷加热水解脱苷形成杨梅素，从而提高最终杨梅素的得率。但是这些强酸都是易污染环境的工业原料，安全性也不高，而且强酸水解杨梅苷后的残留物质很难去除，降低杨梅素纯度。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中杨梅素提取工艺的不足，采用微生物发酵提取法代替传统的硫酸或盐酸提取法，提高杨梅素的提取得率和纯度，且提取方法绿色环保无污染。本专利技术的一个目的通过以下技术方案来实现：一种微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl2溶液中，形成共固定化凝胶珠；2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1-5次，合并滤液加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇，得到提取物，滤渣干燥；3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣，40-50℃下发酵提取140-170h；4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，合并滤液减压浓缩除去乙醇，得沉淀物；6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。作为优选，所述黑曲霉孢子悬浮液中黑曲霉孢子含量为1×108-1×1010CFU/ml，所述乳酸杆菌悬浮液中乳酸杆菌含量为1×109-1×1011CFU/ml。作为优选，所述黑曲霉孢子悬浮液与乳酸杆菌悬浮液以体积比1:(0.8-1.2)混合。作为优选，所述共固定化凝胶珠的直径为2.5-3mm。作为优选，所述杨梅素提取原料为杨梅科或葡萄科植物原料。作为优选，杨梅素提取原料捣碎至30-80目。作为优选，步骤2)与步骤5)的乙醇提取，乙醇体积分数为70-95％，每次提取时间为1-3h。作为优选，步骤3)中共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物的质量比为1:8-12。作为优选，步骤3)的发酵提取温度为48℃。作为优选，步骤4)所用筛网目数为10-30目。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：1、本专利技术采用含有黑曲霉孢子和乳酸杆菌的共固定化凝胶珠发酵杨梅素提取原料，利用纤维二糖酶以及乳酸杆菌的相互协同作用最快及最大程度降解原料纤维素，有利于杨梅素及杨梅苷物质溶解出来；而纤维二糖酶以及乳酸杆菌降解纤维素后的最终产物乳酸将释放出的杨梅苷水解脱苷形成杨梅素，大大提高杨梅素收率及纯度。2、本专利技术使用的黑曲霉孢子和乳酸杆菌以凝胶珠形式固定住，很好地控制了两种微生物之间的配比，使得发酵能长期稳定进行，避免了各菌种在发酵进行中发生改变而造成发酵质量降低。3、本专利技术采用微生物发酵提取法代替传统的硫酸或盐酸提取法,将杨梅素前期提取必备的硫酸、盐酸等易污染环境的工业原料替换为对环境无污染的微生物原料，绿色环保更安全。具体实施方式在下文中，针对本专利技术的微生物发酵提取杨梅素的方法将详细地描述实施方式，然而，这些实施方式是示例性的，本专利技术公开内容不限于此。在本专利技术的一些实施方式中，一种微生物发酵提取杨梅素的方法包括以下步骤：1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl2溶液中，形成共固定化凝胶珠；2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1-5次，合并滤液加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇，得到提取物，滤渣干燥；3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣，40-50℃下发酵提取140-170h；4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，合并滤液减压浓缩除去乙醇，得沉淀物；6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。先制备共固定化凝胶珠：黑曲霉菌株在固体斜面培养基中培养5-7，产生大量孢子。将固体斜面培养基用生理盐水洗下，放入事先灭好菌三角瓶中，搅拌打散，过滤，取孢子，然后离心，离心沉淀物再用生理盐水洗两遍，最后用生理盐水重悬，得黑曲霉孢子含量为1×108-1×1010CFU/ml的黑曲霉孢子悬浮液。将处于对数生长期的乳酸杆菌加生理盐水重悬，得到乳酸杆菌含量为1×109-1×1011CFU/ml的乳酸杆菌悬浮液，乳酸杆菌菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量因此宜采用处于对数生长期的乳酸杆菌。将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌细胞悬浮液以体积比1:(0.8-1.2)混合后，加入至海藻酸钠溶液中，使海藻酸钠的终浓度为2-5％，将混合液搅拌均匀，并用注射器滴入到0.5-2％的CaCl2溶液中，CaCl2溶液处于静止或搅拌状态均可，形成直径为2.5-3mm的共固定化凝胶珠，置于0-6℃冰箱中固化8-15h后保存备用。杨梅素提取原料可以为杨梅科、葡萄科、豆科、杜鹃花科和大戟科等植物的枝皮叶等，优选为杨梅科或葡萄科植物原料。将杨梅素提取原料捣碎，优选捣碎至3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)制备共固定化凝胶珠：将黑曲霉孢子悬浮液和乳酸杆菌悬浮液混合后，加入至海藻酸钠溶液中，采用注射剂将形成的混合液滴入至CaCl2溶液中，形成共固定化凝胶珠；
2)将杨梅素提取原料捣碎，加乙醇回流提取1-5次，合并滤液加压浓缩或者减压浓缩除去乙醇，得到提取物，滤渣干燥；
3)向发酵罐中加水并加入步骤1)中的共固定化凝胶珠、步骤2)中的提取物以及1/5-4/5干燥滤渣，40-50℃下发酵提取140-170h；
4)发酵结束后，用筛网过滤发酵液，除去共固定化凝胶珠；
5)过滤后的发酵液用乙醇回流提取1-5次，合并滤液减压浓缩除去乙醇，得沉淀物；
6)沉淀物反复水洗4～6次，得成品。


2.根据权利要求1所述的微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述黑曲霉孢子悬浮液中黑曲霉孢子含量为1×108-1×1010CFU/ml，所述乳酸杆菌悬浮液中乳酸杆菌含量为1×109-1×1011CFU/ml。


3.根据权利要求1或2所述的微生物发酵提取杨梅素的方法，其特征在于，所述黑...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明谦，纪东艺，姚恩琪，
申请(专利权)人：宁波德康生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33