一种广藿香内生真菌的分离筛选方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，特别涉及一种广藿香内生真菌的分离筛选方法。包括培养基制备步骤，内生真菌的分离与纯化步骤，内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，内生真菌的活性筛选步骤。采用组织块分离法从广藿香植株内分离多种内生真菌菌株，进而用滤纸片法筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。以此获得多种类型的对青枯菌具有拮抗作用的菌株，用形态观察进行拮抗菌的菌株鉴定，用盆栽试验测内生真菌对青枯病菌的生物防控效果，为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供理论基础，并为番茄青枯病生物防治中提供了可供参考的新的菌株资源。

Isolation and screening of Endophytic Fungi from Pogostemon cablin

【技术实现步骤摘要】
一种广藿香内生真菌的分离筛选方法
本专利技术涉及微生物
，特别涉及一种广藿香内生真菌的分离筛选方法。技术背景广藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth.)为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，为广东道地药材，“十大广药”之一。药用植物内生真菌广泛存在于药用植物体内，具有丰富的生物多样性，对寄主植物有着积极的作用，其次生代谢产物有着抗肿瘤、抗氧化、抗菌等活性，在医药、农业等方面有着巨大的应用前景。经调查发现，番茄种植过程中得青枯病，青枯病病害会在短时间内迅速传播，且后期的控制工作也是非常困难的，造成番茄作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，最终导致番茄产量下降，严重损害了种植户的经济效益。从广藿香植株的根、茎、叶分离出的内生真菌，对寄主植物抑制青枯病有着积极的作用。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，采用本专利技术提供的技术方案为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供了理论基础。为了达到上述专利技术目的，本专利技术提供一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，包括以下步骤：培养基制备步骤，用于制备所述内生真菌分离筛选方法所需的培养基；内生真菌的分离与纯化步骤，用于从广藿香植株中分离出内生真菌，并纯化得到内生真菌的菌株；内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，用于通过完成纯化得到的菌株发酵并浓缩得到内生真菌的粗提取物；内生真菌的活性筛选步骤，用于对内生真菌的粗提取物筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。优选的，在培养基制备步骤中，所述培养基包括：由马铃薯、葡萄糖和琼脂培养形成的PDA培养基；由马铃薯、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素B1和水培养形成的PDB液体培养基；由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂培养形成的NA培养基；以及由蛋白胨、牛肉膏和氯化钠培养形成的NA液体培养基。优选的，所述内生真菌的分离与纯化步骤包括以下步骤：A100、采集健康的广藿香植株，清洗并切成小块制成样品；A200、将样品依次浸泡于乙醇、NaClO溶液和乙醇完成消毒杀菌，再用无菌水冲洗；A300、将完成冲洗的样品置于PDA培养基中恒温培养；待样品长出菌丝，及时挑出PDA培养基中的单一菌丝至新的PDA培养基中恒温培养,并反复操作A300，直至获得纯化的若干内生真菌菌株。优选的，内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤包括以下步骤：B100、将步骤A300中纯化得到的内生真菌菌株接种到PDA培养基中；B200、发酵若干天后加入乙酸乙酯浸泡；B300、将浸泡后的PDA培养基捣碎再次浸泡，依次过滤并减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。优选的，所述内生真菌的活性筛选步骤包括以下步骤：C100、取适量步骤B300中得到粗提取物，用DMSO溶液配制成样品溶液；C200、将青枯菌分别培养于若干个NA液体培养基中，经恒温培养摇床振荡培养配制成菌液；C300、蘸取适量菌液分别均匀涂布于若干个NA培养基上，在灭过菌的滤纸片上滴加样品溶液，并将上述滤纸片置于含菌液的NA培养基上；C400、将NA培养基恒温培养，测量其抑菌圈的直径大小，并筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。优选的，所述PDA培养基的制备方法包括由质量浓度比为200～220:20～25:15～20：10-7的马铃薯、葡萄糖、琼脂和硫酸卡那霉素和氨苄青霉素，自然pH值，在121℃高温高压环境中灭菌40～45min培养形成；所述PDA液体培养基的制备方法包括由质量浓度比为200～220:20～25:2～5:0.1～0.2：0.01:1的马铃薯、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素B1和水，自然pH值，在121℃高温高压环境中灭菌25～35min培养形成；所述NA培养基的制备方法包括由质量浓度比为8～11:2～4:4～6:15～20的蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂，在121℃高温高压环境中灭菌25～35min培养形成；所述NA液体培养基的制备方法包括由质量浓度比为8～12:2～3:5～7的蛋白胨、牛肉膏和氯化钠，在121℃高温高压环境中灭菌25～35min培养形成。优选的，在步骤A300中，对获得的内生真菌菌株进行分子生物学鉴定，包括：A301、先对获得的内生真菌菌株初筛选出2株高效菌培养72h，按TSP101试剂盒提取DNA；A302、通过琼脂糖电泳观察后，用通用引物对菌株进行基因组PCR扩增；A303、将扩增后的产物进行基因ITS测序，将测序结果在GenBank中通过BLAST进行比对。优选的，在步骤B200中，在28℃环境下发酵30～40天后，加入乙酸乙酯浸泡2～3h；在步骤B300中，将浸泡后的PDA培养基捣碎再次浸泡12～13h，过滤后，在40～50℃，60r/min下减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。优选的，在步骤C200中，所述NA液体培养基在30℃恒温培养振荡器中振荡培养36h；在步骤C400中，NA培养基置于30℃恒温培养24h。由上可知，应用本专利技术提供的可以得到以下有益效果：采用组织块分离法从广藿香植株分离内生真菌，以期获得多种类型的对青枯菌具有拮抗作用的菌株，用形态观察进行拮抗菌的菌株鉴定，用盆栽试验测生防菌剂对青枯病菌的生物防控效果，并研究其在青枯病生物防治中的相关应用，为广藿香内生真菌的资源利用和防治青枯病提供理论基础，为番茄青枯病生物防治中提供了可供参考的新的菌株资源。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对本专利技术实施例或现有技术的描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例广藿香内生真菌的分离筛选方法流程框图；图2为本专利技术实施例内生真菌的分离与纯化步骤流程框图；图3为本专利技术实施例内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤流程框图；图4为本专利技术实施例内生真菌分子生物学鉴定步骤流程框图；图5为本专利技术实施例内生真菌的活性筛选步骤流程框图；图6为本专利技术实施例GY14菌株抗青枯菌的抑菌圈图；图7为本专利技术实施例GY06菌株抗青枯菌的抑菌圈图；图8为本专利技术实施例GY14菌株抗金黄色葡萄球菌的抑菌圈图；图9为本专利技术实施例GY06菌株抗大肠杆菌的抑菌圈图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1如图1所示，为了解决青枯菌影响农作物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：/n培养基制备步骤，用于制备所述内生真菌分离筛选方法所需的培养基；/n内生真菌的分离与纯化步骤，用于从广藿香植株中分离出内生真菌，并纯化得到内生真菌的菌株；/n内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，用于通过完成纯化得到的菌株发酵并浓缩得到内生真菌的粗提取物；/n内生真菌的活性筛选步骤，用于对内生真菌的粗提取物筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种广藿香内生真菌的分离筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
培养基制备步骤，用于制备所述内生真菌分离筛选方法所需的培养基；
内生真菌的分离与纯化步骤，用于从广藿香植株中分离出内生真菌，并纯化得到内生真菌的菌株；
内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤，用于通过完成纯化得到的菌株发酵并浓缩得到内生真菌的粗提取物；
内生真菌的活性筛选步骤，用于对内生真菌的粗提取物筛选出具有抗青枯菌的内生真菌。


2.根据权利要求1所述的分离筛选方法，其特征在于：在培养基制备步骤中，所述培养基包括：
由马铃薯、葡萄糖和琼脂培养形成的PDA培养基；
由马铃薯、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素B1和水培养形成的PDB液体培养基；
由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂培养形成的NA培养基；以及
由蛋白胨、牛肉膏和氯化钠培养形成的NA液体培养基。


3.根据权利要求2所述的分离筛选方法，其特征在于：所述内生真菌的分离与纯化步骤包括以下步骤：
A100、采集健康的广藿香植株，清洗并切成小块制成样品；
A200、将样品依次浸泡于乙醇、NaClO溶液和乙醇完成消毒杀菌，再用无菌水冲洗；
A300、将完成冲洗的样品置于PDA培养基中恒温培养；待样品长出菌丝，及时挑出PDA培养基中的单一菌丝至新的PDA培养基中恒温培养,并反复操作A300，直至获得纯化的若干内生真菌菌株。


4.根据权利要求3所述的分离筛选方法，其特征在于：内生真菌的固体发酵培育及粗提物制备步骤包括以下步骤：
B100、将步骤A300中纯化得到的内生真菌菌株接种到PDA培养基中；
B200、发酵若干天后加入乙酸乙酯浸泡；
B300、将浸泡后的PDA培养基捣碎再次浸泡，依次过滤并减压浓缩得到内生真菌的粗提取物。


5.根据权利要求4所述的分离筛选方法，其特征在于：所述内生真菌的活性筛选步骤包括以下步骤：
C100、取适量步骤B300中得到粗提取物，用DMSO溶液配制成样品溶液；
C200、将青枯菌分别培养于若干个NA液体培养基中，经恒温培养摇床振荡培养配制成菌液；
C300、蘸取适量菌液分别均匀涂布于若干个NA培养基上，在灭过菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海伟，冯嘉琪，江坤生，付晓晴，陈佳茹，
申请(专利权)人：惠州学院，
类型：发明
国别省市：广东;44