本发明专利技术提供一种鉴定皮革制品猪牛羊物种属性的液质联用方法，包括以下步骤：步骤A:将皮革制品用液氮冷冻后研磨成粉末状或直接剪成碎片，加入适量的水或者蛋白裂解液，于高压灭菌设备中，提取蛋白质；步骤B:将提取液高速离心，取适量上清液于蛋白超滤管中，高速离心后加入碳酸氢铵水溶液，再加入酶进行水解反应；步骤C：酶解完成后，高速离心，收集滤液，用于质谱检测分析。本发明专利技术提供的特征肽在皮革经过工艺加工后仍能有效的检出，且灵敏度高，测定结果准确，解决了皮革制品真假难辨的问题，为皮革制品的物种鉴定提供了可靠的技术手段。
A method of liquid chromatography-mass spectrometry for identification of species properties of leather products
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定皮革制品猪牛羊物种属性的液质联用方法
本专利技术涉及一种皮革制品猪源、牛源和羊源种属鉴别的质谱技术，属于皮革制品物种来源鉴定领域。
技术介绍
天然皮革按其动物来源可分为牛革、羊革、猪革、马革、驴革和袋鼠革等，作为一种天然的高分子材料，天然皮革具有非常良好的使用性能，在箱包、服装、鞋类、汽车、家居等领域得到越来越多的应用。随着经济发展和人们生活水平的提高，天然皮革的需求量与日俱增，逐渐成为时尚潮流的主调，天然皮革的真伪和质量也成为了人们关心的问题。由于天然皮革种类繁多，价格差异较大，一些不法商贩为了寻求利益最大化，以人造革冒充天然皮革，或是以低档皮革冒充高档皮革，损害了广大消费者的健康和利益，对社会经济发展产生了不利影响。目前，天然皮革的材质鉴别仍以手摸眼看的感官鉴定方法为主，虽然也开发了红外、显微镜和PCR等辅助方法，但这些方法的准确性不高，不足以作为标准方法用于皮革属性的鉴定。正因为皮革制品真假难辨，皮革市场的造假现象普遍存在。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供了一种通过检测特征肽段来鉴别皮革制品真伪的液质联用方法。一种用于皮革鉴定的特征肽，包括猪皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：(a)GPTGPAGVR；(b)TGETGASGPP*GFAGEK(P*表示脯氨酸羟基化)；(c)GETGPAGPAGPVGPVGAR；牛皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：(d)GEAGPSGPAGPTGAR；(e)SGETGASGPP*GFVGEK(P*表示脯氨酸羟基化)；(f)SGETGASGPPGFVGEK；羊皮的一条特征肽，氨基酸序列为：(g)GPAGPTGPAGK。上述特征肽段的母离子分别为(a)m/z406.2，(b)m/z739.8，(c)m/z773.9，(d)m/z641.3，(e)m/z746.8，(f)m/z738.9，(g)m/z455.2；由于同位素效应的存在，上述母离子均可存在±3Da的差值。相应的，本专利技术提供一种鉴别皮革真伪的液质联用方法，包括以下步骤：步骤A:将皮革制品用液氮冷冻后研磨成粉末状或直接剪成碎片，加入适量的水或者蛋白裂解液，于高压灭菌设备中，高温高压提取蛋白质；步骤B:将提取液高速离心，取适量上清液于蛋白超滤管中，高速离心后加入碳酸氢铵水溶液，加入酶进行水解反应；步骤C：酶解完成后，高速离心，收集滤液，用于质谱检测分析。本专利技术采用以上技术方案，其优点在于，该方法操作简单，特异性好，灵敏度和准确度高，不受生产工艺的影响，可解决当前天然皮革真假难辨的问题，有效地遏制市场上的假冒伪劣皮革制品，维护皮革市场的经济秩序，保障皮革行业的稳定发展。所述步骤A中，提取蛋白质的温度为60-150℃，提取时间5-40min。所述步骤A中，取蛋白质的温度为90-130℃，提取时间10-25min。所述步骤A中的蛋白裂解液是指由7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％(w/V)CHAPS配制而成的水溶液，在本专利技术中和纯水一样，用作蛋白质的提取剂。优选的，所述步骤B中，酶采用胰蛋白酶，酶解温度控制在30-40℃，酶解时间1-10h，优选3-6h。优选的，所述步骤B中，酶解前可加入二硫苏糖醇打开蛋白质中的二硫键，并用碘乙酰胺对巯基进行烷基化保护。即：加入二硫苏糖醇溶液，恒温反应1个小时，加入碘乙酰胺溶液，避光反应后转移至蛋白超滤管中。优选的，所述步骤B中，也可采用蛋白质直接进行酶解。优选的，所述步骤B中，碳酸氢铵水溶液的浓度为20mmol-200mmol。所述步骤B中，质谱条件为正离子扫描模式，MRM监测模式采集离子信息，根据特征肽信号峰即可确认皮革的动物物种属性。所述步骤C中，液相色谱分离条件为采用C8、C18色谱柱进行分离，以体积浓度0.1％甲酸水溶液和乙腈或者甲醇或者甲醇和乙腈的混合溶剂作为流动相，梯度洗脱。本专利技术的有益效果是：皮革制品经过工艺加工后DNA遭到破坏，传统的PCR方法无法对其物种属性进行鉴定，本专利技术提供的特征肽在皮革经过工艺加工后仍能有效的检出，且灵敏度高，测定结果准确，解决了皮革制品真假难辨的问题，为皮革制品的物种鉴定提供了可靠的技术手段。附图说明图1为猪皮革样品特征肽段a的离子流色谱图。图2为猪皮革样品特征肽段b的离子流色谱图。图3为猪皮革样品特征肽段c的离子流色谱图。图4为牛皮革样品特征肽段d的离子流色谱图。图5为牛皮革样品特征肽段e的离子流色谱图。图6为牛皮革样品特征肽段f的离子流色谱图。图7为羊皮革样品特征肽段g的离子流色谱图。具体实施方式下面结合附图，对本专利技术的较优的实施例作进一步的详细说明：实施例1将标示为猪皮革的皮革样品，剪成碎片，称取0.4g样品置于玻璃管中，加入100mmol碳酸氢铵水溶液3mL，于高压灭菌设备中115℃提取10min，冷却至室温。将提取液移至离心管中，12000r/min离心15min。移取上清液200μL至蛋白超滤管中，加入胰蛋白酶1μg，置于36℃水浴锅中水解5h。14000r/min离心35min，收集滤液，待上质谱检测。检测仪器：沃特世(waters)液相色谱串联ABSCIEX三重四极杆质谱仪。液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，体积浓度0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；流动相的梯度列表如下：质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，选用406.2>556.3、746.8>903.5和455.2>684.4三对离子对进行检测，结果未发现牛和羊的特征肽信号峰，猪的特征肽信号峰有检出，如图1所示，鉴定为猪皮革样品，与标识相符。经PCR方法验证，该皮革样品确实为猪皮革。实施例2将标示为牛皮革的皮革样品，液氮冷冻后研磨成粉状，称取0.5g样品置于玻璃管中，加入水溶液3mL，于高压灭菌设备中105℃提取20min，冷却至室温。将提取液移至离心管中，14000r/min离心10min。移取上清液250μL至离心管中，加入二硫苏糖醇溶液2μL，37℃恒温反应1个小时。加入碘乙酰胺溶液10μL，避光反应30min，转移至蛋白超滤管中。14000rpm离心30min后，加入碳酸氢铵水溶液100μL，14000rpm离心30min，重复洗涤1-3次后，加入碳酸氢铵水溶液100μL，胰蛋白酶2μg，37℃恒温箱中反应10个小时。14000r/min离心35min，收集滤液，待上质谱检测。检测仪器：沃特世(waters)液相色谱串联ABSCIEX三重四极杆质谱仪。液相分离条件为：以C18色谱柱为分离色谱柱，体积浓度0.1％甲酸水溶液和乙腈分别作为A、B流动相；流动相的梯度列表如下：质谱条件为：正离子扫描模式，MRM监测模式，选用739.8>875.4、641.3>726.2和455.2>6本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于皮革鉴定的特征肽，其特征在于，包括猪皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：（a）GPTGPAGVR；（b）TGETGASGPP*GFAGEK（P*表示脯氨酸羟基化）；（c）GETGPAGPAGPVGPVGAR；牛皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：（d）GEAGPSGPAGPTGAR；（e）SGETGASGPP*GFVGEK（P*表示脯氨酸羟基化）；（f）SGETGASGPPGFVGEK；羊皮的一条特征肽，氨基酸序列为：（g）GPAGPTGPAGK。/n
【技术特征摘要】
20190719 CN 20191065504211.一种用于皮革鉴定的特征肽，其特征在于，包括猪皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：（a）GPTGPAGVR；（b）TGETGASGPP*GFAGEK（P*表示脯氨酸羟基化）；（c）GETGPAGPAGPVGPVGAR；牛皮的三条特征肽，氨基酸序列分别为：（d）GEAGPSGPAGPTGAR；（e）SGETGASGPP*GFVGEK（P*表示脯氨酸羟基化）；（f）SGETGASGPPGFVGEK；羊皮的一条特征肽，氨基酸序列为：（g）GPAGPTGPAGK。
2.如权利要求1所述的特征肽，其特征在于，所述特征肽段的母离子分别为（a）m/z406.2，（b）m/z739.8，（c）m/z773.9，（d）m/z641.3，（e）m/z746.8，（f）m/z738.9，（g）m/z455.2。
3.一种如权利要求1所述的鉴别皮革真伪的液质联用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A:将皮革制品用液氮冷冻后研磨成粉末状或直接剪成碎片，加入适量的水或者蛋白裂解液，于高压灭菌设备中，提取蛋白质；
步骤B:将提取液高速离心，取适量上清液于蛋白超滤管中，高速离心后加入碳酸氢铵水溶液，再加...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜业刚，王韦达，张明，刘奕雄，李意，李碧芳，杨俊，
申请(专利权)人：深圳市计量质量检测研究院国家高新技术计量站，国家数字电子产品质量监督检验中心，深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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