一种快速的藻类DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种快速的藻类DNA提取方法，涉及生物体的DNA提取技术领域，能够高效且快速地提取各种藻类样本的DNA，使提取到的DNA浓度高的同时也纯度高，能够直接用于后续的研究与检测。过滤收集50mg藻类样本于1.5mL的离心管中，按顺序依次加入BufferA，BufferB和BufferC，分别进行振荡混匀；离心后沉淀在加入Buffer C，Buffer D和玻璃珠振荡混匀后离心，离心后通过酚氯仿异戊醇去除蛋白，加入异丙醇溶液振荡混匀，加到硅基质膜核酸纯化柱后离心，弃废液后漂洗，漂洗后再次离心干燥，加入洗脱液，得到藻类基因组DNA溶液。

A fast method of DNA extraction from algae

【技术实现步骤摘要】
一种快速的藻类DNA提取方法
本专利技术涉及生物体的DNA提取
，具体为一种快速的藻类DNA提取方法。
技术介绍
宏基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。为了充分认识不可培养微生物的丰富资源，结合现代分子生物学技术的发展，已建立起了许多不需要对微生物进行独立培养的新方法和新技术。如DGGE、16s测序、宏基因组测序等。快速高质量的环境DNA获取是实现上述研究的重要前提，因此有必要进行环境DNA提取方法的研究。目前藻类被认为是导致水华爆发的主要因素。为了检测和预防蓝藻水华，研究相关藻类的产毒基因，提取藻类的基因组DNA进行种属鉴定等已经是相关研究必不可少的步骤。目前环境DNA的方法主要有CTAB法，裂解法，纤维素酶法以及部分商品化的试剂盒。上述对环境DNA的方法虽然可以对藻类或者环境水样进行藻类基因组DNA的提取，但是还存在提取周期较长、提取方法繁琐和提取试剂复杂的问题，提取周期一般需要3小时以上，而且有些商品化试剂盒更是需要6-8个小时的操作，提取方法繁琐则不适合并行高通量研究，提取试剂复杂使成本更加高昂。现有公布专利[CN104818269A]涉及一种蓝藻基因组DNA提取方法，属于生物体的DNA提取
本专利技术通过离心收取100mg藻细胞于1.5mlEp管中，加入50μLBufferA，置于95℃水浴中10min，然后再加入50μlBufferB，混匀，提取后的DNA样品可以直接使用或置于-20℃的冰箱中保存。与现有技术相比，本专利技术所述的蓝藻基因组DNA提取方法，基因组DNA提取时间短，仅需20min左右；大幅度降低藻类基因组DNA提取成本，降低提取成本2/3以上；可以高通量的提取藻类基因组DNA，用于PCR扩增、荧光定量PCR等相关分子生物学研究。但提取的DNA浓度为0.29μg/μL，A260/A280为1.546，虽然提取到基因组DNA的浓度较高，但纯度较低，有蛋白质污染，已经可以用于相关分子生物学研究，但少量蛋白质的存在还是对研究有一定影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速的藻类DNA提取方法，能够高效且快速地提取各种藻类样本的DNA，使提取到的DNA浓度高的同时也纯度高，能够直接用于后续的研究与检测。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种快速的藻类DNA提取方法，包括如下步骤：S1：过滤收集50mg藻类样本于1.5mL的离心管中，加入100微升BufferA和500微升无菌水，混匀后加入400微升BufferB，涡旋震荡混匀30s，再加入300微升BufferC，涡旋震荡混匀30s，后以8000g离心2分钟，去上清；S2：在S1得到的沉淀物中加入300微升BufferC和0.5g0.5mm大小的玻璃珠，涡旋震荡30s，再加入600微升的BufferD，涡旋震荡1min，后以10000g离心2分钟；S3：取750微升S2得到的上清，加入到另一洁净的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇，涡旋震荡30s，后以16000g离心1分钟，S4：将S3得到的溶液小心转移至一新的洁净的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀；S5：将S4得到的样本加到硅基质膜核酸纯化柱上，以12000g离心30s，弃废液，加入1mL的漂洗液，以12000g离心30s，室温干燥2分钟；S6：向S5所得的样本中加入50-100微升的洗脱液，即为藻类基因组DNA溶液，于1％的琼脂糖凝胶中电泳检测；其中，所述的BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、漂洗液和洗脱液的配方如下：BufferA：0.1-1.5mol/LTris-HCl，pΗ＝3-5；BufferB：2-4mol/LNaOH，2％(W/V)Tween20；BufferC：0.1-0.2mol/LTris-HCl，pΗ＝7-9；加双蒸水溶解并调节pΗ＝7-9，定容至10mL；漂洗液：15-25mmol/LNaCl，l-3mmol/LTris-HCl，pΗ＝7.0-8.0；洗脱液：5-15mmol/LTris-HCl，pΗ＝8.0-9.0。优选的，所述的BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、漂洗液和洗脱液具体为：BufferA：1.0mol/LTris-HCl，pΗ＝4.5；BufferB：3.0mol/LNaOH，2％(W/V)Tween20；BufferC：0.1mol/LTris-HCl，pΗ＝8.0；加双蒸水溶解并调节pΗ＝8.0，定容至10mL；漂洗液：20mmol/LNaCl，2mmol/LTris-HCl，pΗ＝7.5；洗脱液：10mmol/LTris-HCl，pΗ＝8.5。优选的，所述的酚氯仿异戊醇调制比例为酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1。优选的，所述的藻类DNA提取方法包括藻类样本的前处理，藻类基因组DNA的提取和纯化。优选的，所述的藻类DNA提取方法提取到的藻类基因组DNA，用于PCR或者定量PCR反应时，除了加入PCR反应所必须的引物、dNTP、缓冲液Mg2+和酶外，还需加入0.1％(W/V)牛血清白蛋白。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、该专利技术所述的藻类基因组DNA提取方法的提取时间短，提取步骤较为简单，适用于各种藻类样本，且使用的药剂相比于传统方法提取用药剂更加简单，控制整个藻类基因组DNA提取过程在30分钟以内，大幅度降低了藻类基因组DNA提取的时间，通过时间的减短使提取成本降低2/3以上；2、该专利技术可以并行提取藻类的基因组DNA，大幅度简化了水环境藻类DNA提取中样本前处理与提取过程，且提取获得的藻类DNA浓度高的同时纯度也较高，能够直接用于PCR扩增，荧光定量PCR，高通量测序等相关分子生物学研究，且在藻类样本的16sV3区中扩增出318bp左右目的基因片段，无非特异性扩增，荧光定量PCR中扩增目标片段大小128bp左右。附图说明图1为湖水中蓝藻样本基因组DNA的提取结果；图2为微囊藻16SV3rDNAPCR扩增；图3为荧光定量PCR检测产毒微囊藻FACHB-315的qPCR扩增曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：藻类基因组DNA提取1、本专利技术试剂：无核酶水，厂家：Ambion，货号：AM9932BSA，厂家：NEB，货号：B90012、本专利技术主要实验仪器：Eppendorf高速冷冻离心机3、凝胶成像系统，厂家：上海勤翔科学仪器有限公司4、进行藻类基因组DNA提取收集不同位置的富含藻类的湖水样本各本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速的藻类DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1：过滤收集50mg藻类样本于1.5mL的离心管中，加入100微升Buffer A和500微升无菌水，混匀后加入400微升Buffer B，涡旋震荡混匀30s，再加入300微升Buffer C，涡旋震荡混匀30s，后以8000g离心2分钟，去上清；/nS2：在S1得到的沉淀物中加入300微升Buffer C和0.5g 0.5mm大小的玻璃珠，涡旋震荡30s，再加入600微升的Buffer D，涡旋震荡1min，后以10000g离心2分钟；/nS3：取750微升S2得到的上清，加入到另一洁净的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇，涡旋震荡30s，后以16000g离心1分钟，/nS4：将S3得到的溶液小心转移至一新的洁净的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀；/nS5：将S4得到的样本加到硅基质膜核酸纯化柱上，以12000g离心30s，弃废液，加入1mL的漂洗液，以12000g离心30s，室温干燥2分钟；/nS6：向S5所得的样本中加入50-100微升的洗脱液，即为藻类基因组DNA溶液，于1％的琼脂糖凝胶中电泳检测；/n其中，所述的Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、漂洗液和洗脱液的配方如下：/nBuffer A：0.1-1.5mol/L Tris-HCl，pΗ＝3-5；/nBuffer B：2-4mol/L NaOH，2％(W/V)Tween 20；/nBuffer C：0.1-0.2mol/L Tris-HCl，pΗ＝7-9；/n...

【技术特征摘要】
1.一种快速的藻类DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：过滤收集50mg藻类样本于1.5mL的离心管中，加入100微升BufferA和500微升无菌水，混匀后加入400微升BufferB，涡旋震荡混匀30s，再加入300微升BufferC，涡旋震荡混匀30s，后以8000g离心2分钟，去上清；
S2：在S1得到的沉淀物中加入300微升BufferC和0.5g0.5mm大小的玻璃珠，涡旋震荡30s，再加入600微升的BufferD，涡旋震荡1min，后以10000g离心2分钟；
S3：取750微升S2得到的上清，加入到另一洁净的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇，涡旋震荡30s，后以16000g离心1分钟，
S4：将S3得到的溶液小心转移至一新的洁净的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀；
S5：将S4得到的样本加到硅基质膜核酸纯化柱上，以12000g离心30s，弃废液，加入1mL的漂洗液，以12000g离心30s，室温干燥2分钟；
S6：向S5所得的样本中加入50-100微升的洗脱液，即为藻类基因组DNA溶液，于1％的琼脂糖凝胶中电泳检测；
其中，所述的BufferA、BufferB、BufferC、BufferD、漂洗液和洗脱液的配方如下：
BufferA：0.1-1.5mol/LTris-HCl，pΗ＝3-5；
BufferB：2-4mol/LNaOH，2％(W/V)Tween20；
BufferC：0.1-0.2mol/LTris-HCl，pΗ＝7-9；



加双蒸水溶解并调节pΗ＝7-9，定容至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李润成，
申请(专利权)人：李润成，
类型：发明
国别省市：江苏;32