一种蟾酥有效成分分离纯化的方法技术

本发明专利技术涉及一种蟾酥有效成分分离纯化的方法，将蟾酥粉以三氯甲烷为溶剂回流提取蒸干，再两次使用硅胶柱色谱分离，并根据化合物极性，配以不同体积比的石油醚‑丙酮混合溶剂进行洗脱，将其中的沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵与其他蟾毒配基成分分离出来，再使用制备薄层进一步纯化，分别得到沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵产物。本发明专利技术提供发方法可以单独分离、纯化出沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵。且简化了蟾酥中沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵三种化学成分的分离方法，提高了三种成分的提取率。

A method of separation and purification of effective components of toad

【技术实现步骤摘要】
一种蟾酥有效成分分离纯化的方法
本专利技术属于中药药物成分分离提取
，涉及一种蟾酥有效成分分离纯化的方法及其产品。
技术介绍
蟾酥(bufonisvenenum)是两栖纲无尾目蟾蜍科动物耳廓和皮肤腺中的一种白色分泌物经干燥处理后的固体成品，是中国的传统中药，被广泛的应用于东亚国家。传统中医将其用于治疗小儿疳疾、脑疳、背部疔疮及肿毒。据中国药典记载，蟾酥辛，温；有毒。归心经，具有解毒，止痛，开窍醒神功能，有毒。用于痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，痧胀腹痛吐泻，是传统中医及现代医学一种重要的动物源中药材。其药源动物主要有黑眶蟾蜍和中华蟾蜍两种。蟾酥化学成分复杂，蟾酥的药理活性强，现代药理和临床应用表明它具有强心、升压、利尿、镇痛及抗肿瘤等多种药理活性。也充分显示蟾酥对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌等多种恶性肿瘤均有非常好的疗效。蟾酥中抗肿瘤活性成分主要为蟾毒配基类和吲哚生物碱类，其中蟾毒配基类主要包含华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等成分，关于其化学性质和药理作用已进行了很多研究。因蟾酥所具有独特药理活性，已经在现代医学中被不断开发，特别是其抗肿瘤的重要特性。所以近年来对蟾酥有效成分的不断深入研究，并建立起了多种蟾酥有效成分的提取方法。不同提取方法和溶剂选择对蟾酥有效成分提取存在明显影响，研究与优化蟾酥提取条件对于蟾酥鉴定与成分分析研究具有重要意义；深入研究蟾酥有效成分的提取和分离以及相应制剂的临床研究，将会使蟾酥这一天然动物药材资源得到充分开发利用，造福于民。分离纯化出蟾酥药物有效成分对进一步研究其药理作用实验、分析提供帮助，为蟾酥的临床安全合理应用提供参考。在现有文献CN101209264B和CN103191133B中均是对蟾酥中提取有效成分混合物的考量。CN102512453B中采用体积百分比为60～95％的乙醇水溶液作为提取溶剂，减少其他有机溶剂的使用量，但最后得到还是酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种脂溶性成分的混合物。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种蟾酥有效成分沙蟾毒精、蟾毒灵和华蟾毒它灵提取、分离、纯化的方法；还提供由分离、纯化方法得到的沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种蟾酥有效成分分离纯化的方法，所述方法包括以下步骤：a.蟾酥粉碎后过20-40目筛，以三氯甲烷为溶剂连续回流提取，提取2-4次，每次4-6小时；合并所有提取液并蒸干，再通风干燥得到粘稠提取物A；蟾酥粉与提取溶剂的比例为1g：1-2mL；b.将提取物A进行硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以100:0；80:1；50:1；30:1；15:1；5:1；0:100七个流分进行梯度洗脱，收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液B；c.将洗脱液B得到的粗品进一步采用硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以30:1；15:1；5:1；0:100四个流分进行梯度洗脱，收集15:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液C；收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液D；d.再将洗脱液C使用制备薄层分离，展开剂为环己烷:三氯甲烷:丙酮＝4:3:3.2，得到华蟾毒它灵和沙蟾毒精；将洗脱液D使用制备薄层分离，展开剂为乙酸乙酯:环己烷＝8.5:1，得到蟾毒灵。进一步，步骤a中蟾酥粉与提取溶剂的比例为1g：1.5mL。进一步，硅胶柱的径高比为1:15。进一步，步骤b中硅胶粒度为200-300目。进一步，其特征在于，步骤c中硅胶粒度为200-300目。进一步，硅胶拌样采用干法拌样。进一步，拌样的硅胶和提取物A质量比1:1.5。进一步，拌样的硅胶和洗脱液B中粗品质量比1:1.5。2.根据以上任一项所述蟾酥有效成分分离纯化的方法得到的华蟾毒它灵。3.根据以上任一项所述蟾酥有效成分分离纯化的方法得到的沙蟾毒精。4.根据以上任一项所述蟾酥有效成分分离纯化的方法得到的蟾毒灵。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种操作简单的蟾酥有效成分分离纯化的方法，可以单独分离、纯化出沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵。且简化了蟾酥中沙蟾毒精、蟾毒灵、华蟾毒它灵三种化学成分的分离方法，提高了三种成分的提取率，且其纯度较高。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为沙蟾毒精样品碳谱；图2为沙蟾毒精样品氢谱；图3为蟾毒灵样品碳谱；图4为蟾毒灵样品氢谱；图5为华蟾毒它灵样品碳谱；图6为华蟾毒它灵样品氢谱。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1蟾酥500g研磨得到490g细粉，过40目筛，以三氯甲烷为溶剂，采用索氏提取器连续回流提取三次(回流料液比1:1.5，温度60-80℃)，每次6小时；将三次提取液合并，蒸干提取液，残渣于通风橱彻底挥发干燥得到粘稠的提取物A160g；回流时间6小时可为3-6小时；1)将提取物A进行硅胶柱色谱分离，采用1500g的200-300目柱色谱硅胶装柱(柱子直径10cm，高度150cm)，240g硅胶拌样(样品：拌样硅胶＝1:1-1:1.5)，采用干法上样，湿法装柱，再以石油醚-丙酮系统(按体积比计)分别以100:0；80:1；50:1；30:1；15:1；5:1；0:100七个流分进行梯度洗脱，每个梯度馏分收集2000ml(约1个柱体积)，7个流分分别命名为Fr-1～Fr-7；2)得到Fr6部分中粗品约13g，对Fr6进一步的采用硅胶柱色谱分离，采用400g的200-300目柱色谱硅胶装柱(直径8cm,高度120cm)，20g硅胶拌样(样品：拌样硅胶＝1:1-1:1.5)，石油醚-丙酮系统分别以30:1；15:1；5:1；0:100四个流分进行梯度洗脱，每个梯度流分收集1000ml，4个流分分别命名为Fr-6-1～Fr-6-4；3)将Fr-6-2部分(这部分约重337mg)进行制备薄层分离，使用的制备薄层板为德国Merck生产的产品--TLCSilicaGelPlate60F254Glassplates，每块薄层板能够载负的Fr-6-2样品量为120mg，展开剂为环己烷：三氯甲烷:丙酮＝4:3:3.2，得到2个样品，样品A(23.6mg)和样品B(47.8mg)，经鉴定后分别为华蟾毒它灵(cinobufotalin)和沙蟾毒精(arenobufagin)，华蟾毒它灵先于沙蟾毒精被展开。将Fr-6-3部分(这部分约重263mg)进行制备薄层分离，展开剂为乙酸乙酯：环己烷＝8.5:1，得到1个样品C，经鉴定后为蟾毒灵(bufalin)。实施例2蟾酥500g研磨得到485g细粉，过20目，以三氯甲烷为溶剂，采用索氏提取器连续回流提取三本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蟾酥有效成分分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/na.蟾酥粉碎后过20-40目筛，以三氯甲烷为溶剂连续回流提取，提取2-4次，每次4-6小时；合并所有提取液并蒸干，再通风干燥得到粘稠提取物A；蟾酥粉与提取溶剂的比例为1g：1-2mL；/nb.将提取物A进行硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以100:0；80:1；50:1；30:1；15:1；5:1；0:100七个流分进行梯度洗脱，收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液B；/nc.将洗脱液B得到的粗品进一步采用硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以30:1；15:1；5:1；0:100四个流分进行梯度洗脱，收集15:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液C；收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液D；/nd.再将洗脱液C使用制备薄层分离，展开剂为环己烷:三氯甲烷:丙酮＝4:3:3.2，得到华蟾毒它灵和沙蟾毒精；将洗脱液D使用制备薄层分离，展开剂为乙酸乙酯:环己烷＝8.5:1，得到蟾毒灵。/n

【技术特征摘要】
1.一种蟾酥有效成分分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a.蟾酥粉碎后过20-40目筛，以三氯甲烷为溶剂连续回流提取，提取2-4次，每次4-6小时；合并所有提取液并蒸干，再通风干燥得到粘稠提取物A；蟾酥粉与提取溶剂的比例为1g：1-2mL；
b.将提取物A进行硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以100:0；80:1；50:1；30:1；15:1；5:1；0:100七个流分进行梯度洗脱，收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液B；
c.将洗脱液B得到的粗品进一步采用硅胶柱色谱分离，硅胶拌样，按体积比计，石油醚-丙酮混合溶剂分别以30:1；15:1；5:1；0:100四个流分进行梯度洗脱，收集15:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液C；收集5:1石油醚-丙酮混合溶剂洗脱得到的洗脱液D；
d.再将洗脱液C使用制备薄层分离，展开剂为环己烷:三氯甲烷:丙酮＝4:3:3.2，得到华蟾毒它灵和沙蟾毒精；将洗脱液D使用制备薄层分离，展开剂为乙酸乙酯:环己烷＝8.5:1，得到蟾毒灵。


2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱仝飞，闫志慧，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：重庆;50