具有降低的脱靶效应的修饰的RNA试剂制造技术

本发明专利技术的一个方面涉及能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)试剂。该dsRNA分子的反义链包含出现在种子区域的至少一个热去稳定化核苷酸；该dsRNA包含至少四个2'‑氟修饰，并且该dsRNA分子的有义链包含配体，其中该配体是ASGPR配体。本发明专利技术的其他方面涉及包含这些适于治疗用途的dsRNA分子的药物组合物以及通过给予这些dsRNA分子来抑制靶基因的表达例如用于治疗各种疾病病症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有降低的脱靶效应的修饰的RNA试剂相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求以下项的权益：2016年11月23日提交的美国临时申请号62/425,907、2017年8月22日提交的美国临时申请号62/548,589、和2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,514，这些申请的内容通过引用以其整体结合在此。
本专利技术涉及具有特定基序的RNAi双链体试剂以及适于治疗使用的RNAi组合物，所述特定基序通过减少不希望的脱靶效应有利于抑制靶基因表达。此外，本专利技术提供了通过给予这些RNAi双链体试剂来抑制靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病。
技术介绍
RNA干扰或“RNAi”是一个最初由Fire和同事创造的术语，用来描述观察到双链RNAi(dsRNA)可以阻断基因表达(Fire等人(1998)Nature[自然]391,806-811；Elbashir等人(2001)GenesDev.[基因与发展]15,188-200)。短dsRNA在许多有机体(包括脊椎动物)中指导基因特异性的转录后沉默，并且已经为研究基因功能提供了一个新的工具。RNAi由RNA诱导沉默复合体(RISC)介导，RISC是破坏与沉默触发物同源的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶。已知RISC包含来自双链RNA触发物的短RNA(大约22个核苷酸)，但是这一活性的蛋白组分仍是未知的。siRNA的脱靶效应之一是miRNA样效应-在RNA干扰中的核心效应物的argonaute蛋白将人工引入以诱导RNA干扰的siRNA作为miRNA(微小RNA)处理。(Lam等人(2015)MolecularTherapyNucleicAcids[分子疗法-核酸](2015)4,e252)。miRNA主要通过种子区域(来自5'末端的位置2-9)与用于基因遏制的靶mRNA之间的碱基配对识别靶基因。由siRNA引起的脱靶源自iRNA的加载有RISC的反义链的种子区域与具有一个或多个mRNA的碱基互补性。在若干个研究中已经报道了siRNA中的miRNA样脱靶效应，并且取决于种子区域的序列影响多种基因的表达，并且严重到足以引起基于siRNA的表型筛选中高达30％的阳性命中。此外，在miRNA的情况下，当种子区域与靶之间的相互作用变弱时，它们也被报道通过其3'末端区域内的补偿配对(3'-补偿配对)沉默靶基因，暗示miRNA样脱靶效应可能是由这种机制调节的。因此，通过明智地应用化学修饰来调节siRNA设计而不损害siRNA基因疗法的基因沉默功效，正在努力消除或降低siRNA的miRNA样脱靶效应。本专利技术即针对这一努力。
技术实现思路
本专利技术提供了dsRNA分子的有效核苷酸或化学基序，其有利于抑制靶基因表达，同时具有降低的脱靶基因沉默效应，以及提供了适用于治疗用途的RNAi组合物。诸位专利技术人尤其发现了其中反义链在种子区域(即，在反义链的5'-末端的位置2-9，从5'-末端开始计数)内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰的dsRNA分子以及具有从约40℃至约80℃的范围内的解链温度的dsRNA分子可以比缺乏去稳定化修饰的亲本dsRNA分子在介导RNA干扰方面更有效。因此，在一个方面，本专利技术提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5'-末端的位置2-9，从5'-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(vi)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(ix)在该反义链的5’末端的平端。在一些实施例中，本专利技术提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5'-末端的位置2-9，优选3-8，从5'-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(vi)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少1、2、3、4或5个2’-脱氧修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(ix)在该反义链的5’末端的平端。在一些实施例中，dsRNA具有从约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃范围的下端，以及从约70℃、75℃或80℃范围的上端的解链温度。在一些实施例中，dsRNA具有从约55℃至约70℃范围内的解链温度。在一些实施例中，dsRNA具有从约57℃至约67℃范围内的解链温度。在一些具体的实施例中，dsRNA具有从约60℃至约67℃范围内的解链温度。在一些另外的实施例中，dsRNA具有从约62℃至约66℃范围内的解链温度。诸位专利技术人还发现，具有至少60℃的解链温度的dsRNA分子在体内和体外更加有效。因此，在一些实施例中，dsRNA具有至少60℃的解链温度。诸位专利技术人还发现，为了使dsRNA分子在体内更有效，在给药后第7天体内(例如在小鼠肝中)必须存在至少40％-50％的反义链。在另一方面，本专利技术进一步提供了用于通过皮下或静脉内给药向受试者中的特定靶递送本专利技术的dsRNA分子的方法。本专利技术进一步提供了将本专利技术的dsRNA分子用于通过皮下或静脉内给药将所述药剂递送至受试者中的特定靶的方法。附图说明本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。图1显示了本专利技术的一些示例性去稳定化修饰。图2显示了反义链中单个(S)-乙二醇核酸(GNA)修饰对体外缀合活性的位置影响。(S)-GNA的单个取代在反义链种子区域(反义链的位置5-8)或反义链种子区域相对面被良好地耐受，但在敏感位置(反义链的位置1和2，以及有义链的位置11和12)不能耐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)分子，该双链RNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链在5'区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰或其前体，其中所述有义链包含ASGPR配体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161123 US 62/425,907;20170822 US 62/548,589;20171.一种能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)分子，该双链RNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链在5'区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰或其前体，其中所述有义链包含ASGPR配体。


2.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该dsRNA包含至少四个2’-氟。


3.根据权利要求2所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。


4.根据权利要求1所述的dsRNA分子，该dsRNA分子具有以下特征：
a)该双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的5′区域的位置4-8；
b)并且该有义链和反义链的每个包含至少两个2’-氟修饰；和
c)附接至该有义链的任一末端的ASGPR配体。


5.根据权利要求4所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。


6.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该反义链具有以下特征中的至少两个：
a)该双链体修饰的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；
d)该反义链的长度为18至35个核苷酸。


7.根据权利要求6所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。


8.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该有义链具有以下特征中的至少一个：
a)附接至该有义链的任一末端的ASGPR配体；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。


9.根据权利要求8所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。


10.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：



其中B是核碱基。


11.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该稳定的修饰位于该反义链的位置7。


12.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配体是通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。


13.根据权利要求8所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·泰勒，S·米尔斯坦，M·K·施莱格尔，M·贾纳斯，V·R·贾达夫，D·福斯特，M·玛诺哈兰，K·G·拉杰夫，M·贾亚拉曼，A·V·凯尔因，松田茂夫，K·沙里塞，J·K·奈尔，M·A·迈尔，A·塞加尔，C·布朗，
申请(专利权)人：阿尔尼拉姆医药品有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US