液滴的形成方法、生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒技术

本发明专利技术涉及液滴的形成方法、生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒，本发明专利技术的液滴的形成方法具有：在具有多个孔的反应容器中，将用于生物分子分析的试剂送液至所述反应容器，使所述试剂填充于多个所述孔的试剂送液工序，和将油性密封液送液至所述反应容器，利用所述油性密封液将多个所述孔内的所述试剂密封，从而形成多个独立的反应容器的密封工序；其中，所述试剂中含有防吸附剂。

Formation method, biomolecular analysis method and biomolecular analysis kit of droplets

【技术实现步骤摘要】
液滴的形成方法、生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒本申请是申请日为2015年2月2日、优先权日为2014年1月31日、中国专利申请号为201580006310.7、专利技术名称为“生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法”的分案申请。
本专利技术涉及生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。本申请基于2014年1月31日于日本申请的日本特愿2014-017942号主张优先权，其内容援引于此。
技术介绍
已知通过对生物分子进行分析来进行疾病或健康状态诊断(体质诊断)。例如，有利用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism：SNP)分析进行的健康状态诊断、利用体细胞突变分析进行的抗癌药给药判断、利用病毒的蛋白或DNA的分析进行的感染病对策等。近来，通过世界性人类基因组分析已经弄清楚了约31亿个碱基对的序列，弄清楚了人的基因数约为3～4万个。人类在个体间存在碱基序列的差异，将特定群体人口的以1％以上的频率存在的碱基序列的差异称作基因多型。其中启示，SNP与多种疾病具有关联性。例如，关于人的遗传疾病认为，一个基因中的SNP是导致生病的原因。另外认为，多个基因中的SNP对生活习惯病或者癌症等也有影响。因此认为，SNP的分析在药物靶点的探索或副作用的预见等药品开发中是极为有效的。因而，SNP的分析作为世界性的巨大项目正在推进。作为药物效果或副作用程度方面存在个体差异的原因之一，可举出与每个人的药物代谢有关的酶群的差异。最近逐渐弄清楚了，该差异是由SNP等基因上的微小差异所导致的。近年来考虑通过预先对患者的基因进行分析以选择最适合的药剂来向患者给药的方法。此外，不仅限于单基因遗传病、对于多因子疾病而言，基因诊断的意义也急速增加。另外，以病原菌或病毒为靶的药物的效果有时是同种，有时每个个体不同，这多是由每个个体的基因的微细差异所导致的。可以预料，今后这样的作为外来因子的病原菌或病毒的基因诊断作为检查对象也会确实地增加。如此，在后基因组时代的医疗中，重要的是能够对人或病原微生物的基因的微小差异、特别是SNP进行分析，可以预料今后其重要性也会增加。一直以来研究了各种对碱基序列的微小差异、特别是SNP进行分析的方法(参照非专利文献1～2)。为了进行实用水平上的分析，要求在低成本、方法的简便性、信号检测时间的长短、检测结果的正确性等方面均优异。但是，到目前为止还未知有满足上述所有要求的方法。对SNP进行分析时，一般情况是目标基因片段在试样中仅微量地含有。此时，需要通过任何方法预先对目标基因进行扩增。PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应)法作为迅速且重现性高的基因扩增法一直以来被大家所熟知。一般来说，为了检测目标基因一个碱基的差异，需要以下两阶段的工序：使用了PCR法等的基因扩增阶段；和研究所扩增的基因的一个碱基的差异的阶段(参照非专利文献3)。但是，需要两阶段工序的方法由于工序多，因此处理变得繁杂。此外，PCR法由于需要进行温度升降，因此需要在装置大型化、耐热性的反应容器和反应液不蒸发方面下功夫。作为不需要二阶段反应的SNP检测方法，有侵入物法。侵入物法不需要PCR的扩增，由于可以等温地促进反应，因此装置可以小型化。但是，在侵入物法中，由于不包括基因的扩增工序，因此信号扩增慢、为了进行检测判定需要数小时的反应时间。侵入物法是使用了酶反应的检测方法。其中，在使用了酶的信号扩增中，作为缩短信号浓度达到饱和的时间的方法，考虑在微小空间内使其反应的方法。在微小空间内进行侵入反应时，由于1个孔内含有的分析对象分子可以达到1个以下、分析对象分子处于表观上被浓缩的状态，因此可以缩短信号达到饱和的时间。另外，由于使进入1个孔内的检测分子为1个以下，因此通过计数获得信号的孔，可以准确地研究检测分子的浓度。例如，专利文献1显示了通过在具有1pl以下容积的微小空间内进行酶反应，能够进行基因检测。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2004-309405号公报非专利文献1：Landegren、Laboratoryprotocolsformutationdetection、Oxforduniversitypress、1996年非专利文献2：Ahmadian等、Biotechniques、第32卷、第1122～1137页、2002年非专利文献3：JBiochemBiophysMethod、第70卷、第50、2007年、789～795页
技术实现思路
专利技术所要解决的课题即，在SNP分析中当利用PCR时能够在短时间内进行检测，但机器构成变得复杂、步骤变得繁杂。另外，在未利用PCR的等温反应中，至SNP分析结束所需要的时间长、反应性低。因此，这些现有的方法并不实用。本专利技术是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供能够进行迅速且定量的生物分子的分析且能够提高反应性的生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。用于解决课题的手段本专利技术第一方式的生物分子分析试剂盒为如下构成：其具有用于进行酶反应的反应容器，所述反应容器包含具有容器形状部的基体部和设置在所述容器形状部的至少内表面的低吸附结构部，所述低吸附结构部与所述酶反应中的作为分析对象的试样和用于所述酶反应的试剂中的至少一个的吸附率比所述基体部的吸附率低；在所述反应容器内进行酶反应时，对由所述酶反应产生的信号进行检测。所述低吸附结构部与所述试样的吸附率比所述基体部低，与所述基体部露出至所述反应容器内的情况相比，所述信号检测时的背景可以更低。所述低吸附结构部与所述试样的吸附率比所述基体部低，与所述基体部露出至所述反应容器内的情况相比，所述信号检测时的信号强度可以更高。为了使所述吸附率比所述基体部低，所述反应容器可以在所述容器形状部的内表面进一步具有所述基体部的表面经改性的改性部，所述容器形状部可以是具有直径为5微米以下的大致圆形的开口部的有底圆柱形状。为了使所述吸附率比所述基体部低，所述反应容器可以在所述容器形状部的内表面进一步具有层叠于所述基体部上的低吸附物质层，所述容器形状部可以是具有直径为5微米以下的大致圆形的开口部的有底圆柱形状。本专利技术第二方式的生物分子分析试剂盒为如下构成：其具有用于进行酶反应的反应容器和能够供给至所述反应容器且在所述酶反应中使用的试剂，所述反应容器具有能够供给作为分析对象的试样的容器形状部及形成有所述容器形状部的基体部；所述试剂含有用于降低所述试样和所述试剂中的至少一个对所述基体部的吸附率的防吸附剂，在所述反应容器内进行所述酶反应时，检测由所述酶反应产生的信号。所述酶反应可以是等温反应。作为分析对象的所述试样可以含有DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一种，分析对象物质可以是DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白中的任一种。分析对象物质可以是核酸、所述酶反应可以是侵入反应。所述试剂可以通过荧光、发光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液滴的形成方法，其具有：/n在具有多个孔的反应容器中，/n将用于生物分子分析的试剂送液至所述反应容器，使所述试剂填充于多个所述孔的试剂送液工序，和/n将油性密封液送液至所述反应容器，利用所述油性密封液将多个所述孔内的所述试剂密封，从而形成多个独立的反应容器的密封工序；/n其中，所述试剂中含有防吸附剂。/n

【技术特征摘要】
20140131 JP 2014-0179421.一种液滴的形成方法，其具有：
在具有多个孔的反应容器中，
将用于生物分子分析的试剂送液至所述反应容器，使所述试剂填充于多个所述孔的试剂送液工序，和
将油性密封液送液至所述反应容器，利用所述油性密封液将多个所述孔内的所述试剂密封，从而形成多个独立的反应容器的密封工序；
其中，所述试剂中含有防吸附剂。


2.根据权利要求1所述的液滴的形成方法，其中，
所述防吸附剂为表面活性剂。


3.根据权利要求1或2所述的液滴的形成方法，其中，
所述反应容器具有基体部，
多个所述孔设置在所述基体部，
所述基体部在所述基体部的表面中位于多个所述孔之间的部位具有疏水性面。


4.根据权利要求1或2所述的液滴的形成方法，其中，
所述防吸附剂吸附于所述反应容器的内表面。


5.根据权利要求1或2所述的液滴的形成方法，其中，
在所述反应容器的位于相邻的所述孔之间的区域形成有低吸附结构部。


6.根据权利要求1或2所述的液滴的形成方法，其中，
所述反应容器具有流路，所述试剂及所述密封液通过被送液至所述流路而被送液至所述反应容器。


7.根据权利要求1或2所述的液滴的形成方法，其中，
所述试剂含有分析对象物质。


8.一种液滴的形成方法，其具有：
在具有多个孔的反应容器中，
所述反应容器中预先充满了缓冲液，
将用于生物分子分析的试剂送液至所述反应容器，将多个所述孔的各孔内的所述缓冲液中的至少一部分替换为所述试剂的试剂送液工序，和
将油性密封液送液至所述反应容器，利用所述油性密封液将多个所述孔内的所述试剂密封，从而形成多个独立的反应容器的密封工序；
其中，所述试剂或缓冲液中的至少一个含有防吸附剂。


9.根据权利要求8所述的液滴的形成方法，其中，
通过将所述缓冲液送液至所述反应容器，使所述反应容器中充满所述缓冲液。


10.根据权利要求9所述的液滴的形成方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：牧野洋一，国富朋子，
申请(专利权)人：凸版印刷株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP