从生物流体中分离微小RNA制造技术

本公开提供用于从生物流体中分离miRNA的方法和试剂盒。具体地说，所述方法包括使生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；并且将miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。进一步提供可与循环miRNA缔合的miRNA结合蛋白的实例。

Separation of microRNA from biological fluid

The invention provides a method and a kit for separating miRNA from a biological fluid. Specifically, the method comprises contacting a biological fluid with a surfactant and an anti miRNA binding protein reagent, wherein the surfactant breaks down the biological fluid group and the anti miRNA binding protein reagent interacts with the miRNA binding protein associated with the miRNA to form an immunoprecipitated miRNA complex; and releasing miRNA from the immunoprecipitated miRNA complex. Further, an example of miRNA binding protein that can associate with circulating miRNA is provided.

【技术实现步骤摘要】
从生物流体中分离微小RNA本申请是以下申请的分案申请：申请日：2014年11月25日；申请号：201480074125.7(PCT/US2014/067321)；专利技术名称：“从生物流体中分离微小RNA”。
本公开涉及从生物流体中分离微小RNA的方法。背景微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA，其通过经由特定碱基配对相互作用来对特定信使RNA(mRNA)靶标进行转录后调控而影响基因调控网络。miRNA已被证明以无细胞形式存在于人生物液体中。这些无细胞miRNA可为非囊泡的、由miRNA-蛋白质复合物中的蛋白质来结合并保护、封闭于膜结合囊泡诸如外来体或微泡中，或两种情况同时存在。鉴于miRNA在疾病中的重要功能作用，此组核酸分子含有候选物，所述候选物用于诊断和预后疾病，并且在各种患者和表现疾病之前的受试者中，在易于得到的生物样品，诸如血清和血浆、尿液或唾液中监测对于治疗的响应。当前分离miRNA的方法针对细胞和组织中的相对丰富的miRNA，使用不容易自动化或扩大规模的吸附柱，较复杂并且涉及毒性化合物，或可能特定地分离囊泡或非囊泡miRNA。此外，在诊断或预后方面受到关注的miRNA经常以低丰度存在于生物流体中，使得使用当前分离方法来对其进行检测具有挑战性。因此，需要用于分离生物流体中的全部或大部分miRNA的简单、有效、可自动化和可规模化的方法。专利技术概述本公开的一个方面提供从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法。所述方法包括使生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中表面活化剂使生物流体组分解离并且抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物。所述方法还包括将miRNA从免疫沉淀miRNA复合物中释放。本公开的另一个方面包涵用于从生物流体中分离微小RNA的试剂盒。试剂盒包括表面活性剂、抗miRNA结合蛋白试剂和miRNA释放试剂。本公开的其它方面和重复在以下更详细描述。附图简述图1提供将使用TriBD或RNA免疫沉淀反应(RIP)从0.2ml血浆分离miRNA进行比较的两个图表。通过RIP分离的miRNA的量表示为使用TriBD分离的miRNA的倍数差异。(A)描绘let-7a-5p、23a-3p和191-5pmiRNA的水平，并且(B)示出142-3p和451amiRNA的水平。图2提供展示使用Ago-RIP或Qiagen柱纯化试剂盒(Q1，Q2)从血浆分离的miRNA的水平的三个图表。展示let-7a、23a和142miRNA(A)、191miRNA(B)和451amiRNA(C)的以洗脱miR拷贝数/μl为单位的分离miRNA的量。图3提供展示使用利用生物素化(b-Ago2或b-Ago)或非生物素化(Ago2)抗体与链霉抗生物素蛋白或蛋白质A珠粒进行的RIP从血浆分离的miRNA的水平的三个图表。展示了let-7a(A)、23a(B)和191(C)miRNA的以洗脱miR拷贝数/μl为单位来表示的分离miRNA的量。所使用的抗体(圆括号中的克隆)在x轴上表示。图4提供展示使用伴以放热的Ago-RIP从血浆分离的miRNA的水平的两个图表。Q代表Qiagen柱纯化；RIP-Q代表免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化；bRIP-Q代表使用生物素化抗体的免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化。(A)描绘使用Qiagen柱纯化、与柱纯化组合的RIP和伴以蛋白水解酶K释放的RIP的合成cel-miR-39-3p跟踪标定物的水平。跟踪标定物的水平表示为在分离期间跟踪标定的合成cel-miR-39-3p的总百分比。(B)描绘使用Qiagen柱纯化、与柱纯化组合的RIP和具有蛋白水解酶K释放的RIP的从血浆分离的let7amiRNA的水平。let7a的水平以1μl回收样品中的let7a的拷贝数来表示。图5提供展示使用在不同温度下伴以蛋白水解酶K释放的Ago-RIP从血浆分离的miRNA的水平的两个图表。(A)描绘由蛋白水解酶K释放的let7amiRNA的水平(在每个温度下的左侧棒)，和保持于珠粒上的水平(在每个温度下的右侧棒)。let7amiRNA的水平表示为在使用Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒来分离的0.2ml相同血浆中的let7amiRNA的总百分比。(B)描绘由蛋白水解酶K释放的miR451amiRNA的水平(在每个温度下的左侧棒)，和保持在珠粒上的水平(每个温度下的右侧棒)。miR451amiRNA的水平表示为在使用Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒来分离的0.2ml相同血浆中的miR451amiRNA的总百分比。图6提供展示使用可购得的miRNA分离方法，或使用在标准试管中伴以蛋白水解酶K释放的RIP的分离从血浆中分离的let7a(A)或miR451a(B)miRNA的水平的两个图表。E1和E2代表使用来自Exiqon的miRCuryRNA分离试剂盒-生物流体的miRNA分离。Q1和Q2代表使用来自Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒的miRNA分离。RIP-std-Q代表免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化。miRNA的水平表示为从0.2ml血浆回收的总拷贝数。图7提供展示使用可购得的miRNA分离方法，或使用伴以蛋白水解酶K释放的Ago-RIP的分离(RIP1-4)从血浆中分离的let7amiRNA的水平的两个图表。(A)示出试验1并且(B)示出试验2。E1和E2代表使用来自Exiqon的miRCuryRNA分离试剂盒-生物流体的miRNA分离。Q1和Q2代表使用来自Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒的miRNA分离。let7a的水平表示为从0.2ml血浆回收的let7a的总拷贝数。图8提供展示在存在或不存在蛋白水解酶和RNA酶抑制剂的情况下，以及在存在或不存在清洁剂预处理的情况下，使用Ago-RIP随后蛋白水解酶K释放从血浆中分离的miRNA的水平的两个图表。+pre，+inh；将Igepal和抑制剂添加至血浆并且孵育～30分钟，然后添加至Ago2-珠粒。+pre，-inh；在没有抑制剂的情况下将Igepal添加至血浆并且孵育～30分钟，然后添加至Ago2-珠粒。-pre，+inh；Igepal和抑制剂与Ago2-珠粒同时添加至血浆。-pre，-inh；Igepal在没有抑制剂的情况下与Ago2-珠粒同时添加至血浆。(A)描绘回收的let7amiRNA的拷贝数，并且(B)描绘回收的miR451amiRNA的拷贝数。图9提供展示作为总IGEPAL处理miRNA的百分比的自由(每个miRNA的左侧棒)和囊泡(每个miRNA的右侧棒)指示miRNA的水平的图表。图10提供展示使用Ago-RIP随后蛋白水解酶K释放(RIP)从0.2或0.4ml血浆中，或使用来自Exiqon的miRCuryRNA分离试剂盒-生物流体(E)从0.2ml血浆中分离的miRNA的水平的三个图表。(A)描绘回收的l本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括(a)使所述生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；和(b)在未纯化的情况下使miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。/n

【技术特征摘要】
20131127 US 61/909834;20140428 US 61/9850001.一种用于从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括(a)使所述生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；和(b)在未纯化的情况下使miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物流体包括囊泡miRNA和非囊泡miRNA。


3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。


4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。


5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物流体同时与所述表面活性剂和所述抗miRNA结合蛋白试剂接触。


6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将所述生物流体、所述表面活性剂和所述抗miRNA结合蛋白试剂孵育约30分钟。


7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在室温下孵育所述生物流体、所述表面活性剂和所述抗miRNA结合蛋白试剂。


8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：C克里德，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US