透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物、聚多肽纳米粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸‑g‑聚酪氨酸‑硫辛酸共聚物、聚多肽纳米粒及其制备方法与应用。首先，通过开环聚合以及羧基与氨基的反应得到HA‑PTyr‑LA共聚物，该方法简便可控，且制得的聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性。然后，用该聚合物经自组装得到粒径可控、稳定性好、具有还原响应性和高载药量的纳米粒。该纳米药物能在体内长循环，有效地富集到肿瘤部位，进而较好地抑制4T1皮下肿瘤的生长，更能有效地防止乳腺癌细胞在肺部的远端转移。

Hyaluronic acid-g-polytyrosine-lipoic acid copolymer, polypeptide nanoparticles and their preparation and Application

The invention discloses a hyaluronic acid \u2011 g \u2011 polytyrosine \u2011 thiooctanoic acid copolymer, a polypeptide nanoparticles and a preparation method and application thereof. Firstly, ha \u2011 pTyr \u2011 La copolymers were obtained by ring opening polymerization and the reaction of carboxyl group and amino group. This method is simple and controllable, and the polymer has good biocompatibility and biodegradability. Then, nanoparticles with controllable particle size, good stability, reduction response and high drug loading were obtained by self-assembly of the polymer. The nano drug can circulate in the body for a long time, effectively enrich to the tumor site, and then inhibit the growth of 4T1 subcutaneous tumor, and effectively prevent the metastasis of breast cancer cells in the lung.

【技术实现步骤摘要】
透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物、聚多肽纳米粒及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种生物相容性、生物可降解的透明质酸、聚酪氨酸材料及其应用，具体涉及一种硫辛酸-聚酪氨酸修饰的透明质酸接枝聚多肽材料的合成及由其制备的一种可逆交联的聚多肽纳米粒在憎水性化疗药物高效包载和靶向递送中的应用。
技术介绍
聚多肽具有优异的生物相容性、良好的可降解性、易于修饰等特点，被越来越多地用于构建药物递送系统。目前已经有多种聚多肽纳米药物进入临床试验阶段；然而，现有聚多肽纳米载体仍存在着一些缺点，如注射到体内后药物易早释、肿瘤靶向效果差、药物到达肿瘤组织后释放缓慢等。因此，需要研发新的方法以构建高载药效率、交联稳定和靶向释放的纳米药物，可望大大提高现有纳米药物对肿瘤的治疗功效。
技术实现思路
本专利技术设计合成了硫辛酸-聚酪氨酸接枝的透明质酸共聚物及由其制备得到的可逆交联和肿瘤靶向的聚多肽纳米粒用于憎水性抗肿瘤药物的高效包载和靶向递送，结果表明聚多肽纳米药物可以有效地提高治疗效果，并能减小毒副作。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种具有式I结构的透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物（HA-g-PTyr-LA）：其中，m为35～150，n为7～20，x为30～110，y为m-x；优选的，m为45～95，n为10～15，x为35～70。本专利技术公开了上述透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物（HA-g-PTyr-LA）的制备方法，包括如下步骤：（1）在氮气条件下，以单端为氨基的硫辛酸（LA-NH2）为小分子引发剂，通过开环聚合L-酪氨酸N-羧基内酸酐（Tyr-NCA）得到聚酪氨酸（LA-PTyr）；（2）以透明质酸、硫辛酸-聚酪氨酸(LA-PTyr)为原料，反应得到透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物HA-g-PTyr-LA。本专利技术还公开了聚多肽纳米载体的制备方法，所述纳米粒的制备方法包括如下步骤：（1）在氮气条件下，以单端为氨基的硫辛酸（LA-NH2）为小分子引发剂，通过开环聚合L-酪氨酸N-羧基内酸酐（Tyr-NCA）得到聚酪氨酸（LA-PTyr）；（2）以透明质酸、硫辛酸-聚酪氨酸(LA-PTyr)为原料，反应得到透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物HA-g-PTyr-LA；（3）搅拌下，将透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚多肽纳米粒；或者搅拌下，将透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析、交联得到聚多肽纳米粒。本专利技术还公开了一种纳米药物及其制备方法，所述纳米药物的制备方法为：搅拌下，将式I结构的透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物与药物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到纳米药物；或者搅拌下，将式I结构的透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物与药物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析、交联得到纳米药物。上述技术方案中，步骤（1）中，L-酪氨酸N-羧基内酸酐、单端为氨基的硫辛酸的摩尔比为7～20∶1，开环聚合的温度为30℃，时间为72小时。上述技术方案中，步骤（1）中，开环聚合在溶剂中进行，溶剂优选DMF。上述技术方案中，步骤（2）中，先用活化剂活化透明质酸，再与硫辛酸-聚酪氨酸反应得到透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物（HA-g-PTyr-LA）；所述活化剂为1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。上述技术方案中，步骤（2）中，硫辛酸-聚酪氨酸与透明质酸的羧基的摩尔比为0～0.5∶1，不含0，比如0.10、0.30和0.40；反应的温度30℃，反应24小时。上述透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物（HA-g-PTyr-LA）的制备方案的具体反应步骤可举例如下：将Tyr-NCA（4.9mmol）溶解于12mLDMF中，在氮气环境下，慢慢滴加至溶有LA-NH2（0.4mmol）的DMF（4mL）溶液中，置于30℃油浴中反应；然后用过量的冰乙醚沉淀，离心后收集沉淀置于真空干燥箱中干燥24h得到聚合物LA-PTyr；将HA(900mg,2.4mmol-COOH)充分溶解于二次水(35mL)中，然后再向该溶液中加入EDC（460mg,2.4mmol）和NHS（138mg,1.2mmol）,待溶液澄清后用1.2MHCL将反应溶液的pH值调节在5.0进行HA羧基的活化，活化时间为30分钟；然后用2.0MNaOH调节反应溶液的pH到9.0，然后，将LA-PTyr（1800mg,0.8mmol）的DMSO(50mL)溶液缓慢加入上述溶液中，在30oC下搅拌反应24小时；反应结束后，先用DMSO透析2天，随后再用一次水继续透析两天（Spectra/Pore,MWCO7000），最后冷冻干燥得到白色固体HA-g-PTyr-LA。上述制备方案可表示如下：本专利技术中，药物为憎水性抗肿瘤药物；纳米药物中，可逆交联的聚多肽纳米粒可通过憎水作用和π-π堆积作用，实现对憎水小分子药物的高效包载和肿瘤靶向递送。本专利技术制备方法中，透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的溶液、透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物与药物的混合溶液中，溶剂为DMSO；缓冲溶液为pH7.4，5mM的PB缓冲溶液；搅拌速度为500rpm；透析为在截留分子量为3.5K的透析袋中以pH7.4的HEPES缓冲溶液为介质透析6h，每1h换一次透析介质；交联在37℃200rpm的摇床中交联12h，优选交联后将混合溶液转移到透析袋中用PB(pH7.4,5mM)透析2小时；优选交联剂为DTT。本专利技术进一步公开了上述透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物在制备抗肿瘤药物载体或者抗肿瘤药物中的应用；所述纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。由于上述技术方案的应用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点：本专利技术设计制备的HA-g-PTyr-LA共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性，且制备简单、重复可控；设计构建的聚多肽纳米粒子具有粒径可控（60~100nm）、交联稳定和还原响应性的特性；同时，还可通过憎水作用和π-π堆积作用，实现对抗肿瘤小分子药物的高效包载；另外，纳米载体表面的靶向分子多糖实现了该纳米药物的肿瘤靶向递送；同时制备方法简单，所用原料来源广泛且便宜，具有良好的应用前景。附图说明图1是实施例一中LA-PTyr的核磁氢谱图（A）；MALDI-TOF谱图（B）；图2是实施例二中HA-g-PTyr-LA的核磁氢谱图；图3是实施例三和实施例四中载药纳米粒子的粒径分布及透射电子显微镜图（A）；载药纳米粒的稳定性（B）；还原响应性（C）；体外释放行为（D）；图4是实施例五中CMHN空纳米载体对4T1细胞的细胞毒性（A）；载药纳米粒（DTX-CMHN）对4T1细胞的毒性（B）；图5是实施例六中载药纳米粒子的抗肿瘤细胞迁移和侵袭细性能：图（A）划痕图片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有式I结构的透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物；/n

【技术特征摘要】
1.一种具有式I结构的透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物；



其中，m为35～150，n为7～20，x为30～110,y为m-x。


2.权利要求1所述透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的制备方法，包括如下步骤：
（1）在氮气条件下，以单端为氨基的硫辛酸为引发剂，通过开环聚合L-酪氨酸N-羧基内酸酐得到硫辛酸-聚酪氨酸；
（2）以硫辛酸-聚酪氨酸和透明质酸为原料，反应得到所述透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，L-酪氨酸N-羧基内酸酐、单端为氨基的硫辛酸的摩尔比为7～20∶1；开环聚合的温度为30℃，时间为72小时。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，先用活化剂活化透明质酸，再与硫辛酸-聚酪氨酸反应得到透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物；硫辛酸-聚酪氨酸与透明质酸的羧基的摩尔比为0～0.5∶1，不含0；反应的温度30℃，反应24小时。


5.一种聚多肽纳米粒，其特征在于，所述聚多肽纳米粒的制备方法包括如下步骤：
（1）在氮气条件下，以单端为氨基的硫辛酸为小分子引发剂，通过开环聚合L-酪氨酸N-羧基内酸酐得到聚酪氨酸；
（2）以透明质酸、硫辛酸-聚酪氨酸为原料，反应得到透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物；
（3）搅拌下，将透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到聚多肽纳米粒；或者
搅拌下，将透明质酸-g-聚酪氨酸-硫辛酸共聚物的溶液滴加到缓冲溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓超，方慧敏，顾晓雷，钟志远，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32