高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用制造技术

本发明专利技术提供一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及其应用，该芯片包括两层结构，一层为生物分析基底用于细胞外囊泡捕获、检测，另一层为具有高通量阵列的芯片用于单细胞捕获。本发明专利技术将微流控芯片技术、单细胞分析技术应用于细胞外囊泡的研究，利用免疫亲和的方法，可实现高通量、多参数的捕获、检测单个细胞分泌的各种尺寸的细胞外囊泡。进而在单细胞水平对细胞外囊泡的分泌进行了定性、定量检测、相关性分析、多功能性分析、免疫分型分析，清晰展示了细胞与细胞间分泌细胞外囊泡的异质性。

High throughput and multi parameter single cell extracellular vesicle analysis chip and its application

The invention provides a high-throughput and multi parameter single cell source extracellular vesicle analysis chip and its application. The chip includes two layers of structure, one is a biological analysis substrate for extracellular vesicle capture and detection, the other is a chip with high-throughput array for single cell capture. The invention applies microfluidic chip technology and single cell analysis technology to the research of extracellular vesicles. By using the method of immune affinity, it can realize the capture of high flux and multiple parameters, and detect the various sizes of extracellular vesicles secreted by single cells. At the single cell level, the secretion of extracellular vesicles was qualitatively and quantitatively detected, correlation analysis, multi-functional analysis and immunotyping analysis, which clearly showed the heterogeneity of extracellular vesicles secreted between cells and cells.

【技术实现步骤摘要】
高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用
本专利技术涉及微流控芯片技术、单细胞分析技术以及免疫学领域，特别提供了一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用。
技术介绍
细胞外囊泡(EVs),是一类由细胞分泌的双层脂质膜结构的微小囊泡。近年来研究发现细胞外囊泡在细胞间信息间通信中扮演十分重要的角色。几乎所有的细胞都能产生细胞外囊泡，其中含有脂质、蛋白质、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA)等多种母细胞来源的生物活性成份，这些信息物质包裹在囊泡中或携带于膜上。他们参与炎症免疫反应、细胞间信号通讯、细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等，在生理状态维持及疾病的进程中发挥重要作用。在细胞外囊泡的膜表面，有一类跨膜蛋白，例如CD63、CD81、CD9等。利用特异性免疫反应，捕获抗体与膜表面的抗原分子相结合，可以实现对细胞外囊泡的捕获。单细胞分析技术目前广泛应用于DNA、RNA、分泌蛋白等研究，但是该技术在细胞外囊泡研究方面尚不成熟。本专利技术涉及一种高通量多参数的单细胞细胞外囊泡分析芯片。
技术实现思路
本专利技术涉及一种高通量、多参数的单细胞源性细胞外囊泡(EVs)分析芯片。构建高通量单细胞捕获及其分泌的细胞外囊泡的捕获、检测平台，以及在单细胞水平分析细胞外囊泡，展示细胞与细胞间分泌细胞外囊泡的异质性。本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种高通量、多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，该芯片包括两层结构，一层为生物分析基底，另一层为具有高通量阵列的芯片；所述生物分析基底用于细胞外囊泡捕获、检测，所述高通量阵列的芯片用于单细胞捕获。所述生物分析基底为包被了蛋白、抗体或DNA的玻片、或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片；所述的玻片包括但不限于多聚赖氨酸玻片、环氧树脂玻片。所述阵列为1-100条平行不交叉的有特定宽度与间距的条带，每条条带宽度为5um-5000um，间距为5um-5000um。所述具有高通量阵列的芯片为具有高通量微孔阵列的芯片或具有高通量条带阵列的芯片。所述具有高通量阵列的芯片的材质包括但不限于PDMS或各种修饰后的PDMS。所述微孔阵列为正多边形、矩形或圆形阵列，阵列中微孔数目为1～1000000个/cm2。一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片的应用，该芯片用于捕获、检测分析多种细胞的单细胞分泌的不同种细胞外囊泡，或者细胞—细胞相互作用后分泌的不同种细胞外囊泡，所述的多参数单细胞源性细胞外囊泡分析包括1-100个指标的分析。所述细胞外囊泡包括但不限于微小囊泡、外泌体、癌小体、凋亡小体。所述的多种细胞包括但不限于哺乳动物细胞、动物细胞、肿瘤病人病灶细胞。所述分析内容包括对不同种细胞外囊泡进行定性、定量检测、相关性分析、多功能性分析、免疫分型分析，清晰展示细胞与细胞间分泌细胞外囊泡的异质性。一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片的应用，所述的捕获、检测细胞外囊泡的应用方法，具体为：取出包被了不同种捕获抗体形成抗体条码阵列的生物分析基底；将细胞以一定密度种在微孔阵列芯片上；盖上包被了捕获抗体的玻片，用夹具固定，置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养12-24小时；显微镜拍照；卸下夹具，滴加细胞外囊泡染色试剂进行同一单细胞多种细胞外囊泡的检测；所述的染色试剂包括但不限于PKH67或生物素化的抗体和荧光标记的链霉亲合素。生物分析基底包被不同种捕获抗体形成抗体条码阵列，其抗体条码阵列可采用包括但不限于流动固定、打印及其他方法实现。本专利技术的优点在于：1.本专利技术芯片的高通量微孔阵列可实现体外环境下简单、高效的高通量单细胞捕获及培养；2.该芯片可用于捕获不同种细胞分泌的不同种细胞外囊泡；3.该芯片可实现单细胞源性细胞外囊泡的免疫分型研究；4.该芯片可实现研究对象的多参数同时检测；5.该芯片可用于单细胞多种分泌物的研究，如同时检测多种细胞外囊泡和多种细胞因子；6.该芯片所得结果可用多种分析方法进行系统分析，如免疫分型分析，可展示细胞亚群的形象化等；7.基于微流控芯片平台的细胞外囊泡研究，芯片制作简便、材料价格低廉，抗体用量少，可以普遍适用于高通量、多参数的细胞外囊泡研究。附图说明图1为本专利技术实施例1和实施例2提出的一种高通量、多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片的结构示意图；图2为图1中生物分析基底及其局部放大图；图3为图1中高通量微孔阵列芯片及其局部放大图，图4为图1中高通量、多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片应用于单细胞细胞外囊泡捕获、检测时结构示意图；其中：1为生物分析基底，2为具有高通量阵列的芯片，3为夹具；11-19为条带起始段，21-29为条带终止端，20为其中一条条带的示意图；30为其中一个微孔的示意图。图5为抗体在玻片上形成抗体条码阵列的抗体均匀性检测图。图6为细胞外囊泡原子力显微镜图。图7为图6中单个细胞外囊泡尺寸测量图。图8为UM-SCC6单细胞细胞外囊泡玻片扫描部分结果图。图9为UM-SCC6单细胞热图。图10为UM-SCC6细胞分泌细胞外囊泡及细胞因子散点图。图11为UM-SCC6相关性分析图。图12为UM-SCC6多功能性分析。图13为UM-SCC6单细胞免疫分型分析图。图14为原代口腔鳞癌单细胞细胞外囊泡玻片扫描部分结果图。图15为原代口腔鳞癌单细胞热图。图16为原代口腔鳞癌细胞分泌细胞外囊泡及细胞因子散点图。图17为原代口腔鳞癌相关性分析图。图18为原代口腔鳞癌多功能性分析。图19为原代口腔鳞癌单细胞免疫分型分析图。图20为实施例3中群体细胞实验生物分析基底及其局部放大图。图21为实施例3中群体细胞实验高通量阵列的芯片及其局部放大图，其中：1为生物分析基底，2为具有高通量阵列的芯片，11-19为条带起始端，21-29为条带终止端，200为其中一条条带的示意图。31-39为通道起始端，41-49为通道终止端，300为其中一条通道的示意图。图22为群体细胞实验部分玻片扫描结果图。图23为群体细胞实验结果分析图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方法、优点更加清晰明了，下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，本专利技术所使用的实验试剂均为市购，如表1所示。表1本实验所用试剂列表。实施例1本实施例一种高通量、多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，参阅图1-图3。该芯片包括两层结构，一层为生物分析基底1，另一层为具有高通量阵列的芯片2，所述的具有高通量阵列的芯片为具有高通量微孔阵列的芯片。所述具有高通量微孔阵列的芯片本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于该芯片包括两层结构，一层为生物分析基底，另一层为具有高通量阵列的芯片；所述生物分析基底用于细胞外囊泡捕获、检测，所述高通量阵列的芯片用于单细胞捕获。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于该芯片包括两层结构，一层为生物分析基底，另一层为具有高通量阵列的芯片；所述生物分析基底用于细胞外囊泡捕获、检测，所述高通量阵列的芯片用于单细胞捕获。


2.根据权利要求1所述的一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于所述生物分析基底为包被了蛋白、抗体或DNA的玻片，或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片；
所述的玻片包括但不限于多聚赖氨酸玻片、环氧树脂玻片。


3.根据权利要求2所述的一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于所述的阵列为1-100条平行不交叉的有特定宽度与间距的条带，每条条带宽度为5um-5000um，间距为5um-5000um。


4.根据权利要求1所述的一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于所述具有高通量阵列的芯片为具有高通量微孔阵列的芯片或具有高通量条带阵列的芯片；
所述具有高通量阵列的芯片的材质包括但不限于PDMS或各种修饰后的PDMS。


5.根据权利要求4所述的一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片，其特征在于所述微孔阵列为正多边形、矩形或圆形阵列，阵列中微孔数目为1～1000000个/cm2。


6.根据权利要求1所述的一种高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片的应用，其特征在于该芯片用于捕获、检测分析多种细胞的单细胞分泌的不同种细胞外囊泡，或者细胞—细胞相互作用后分泌的不同种细胞外囊泡，
所述的多参数单细胞源性细胞外囊泡分析包括1-100个指...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆瑶，冀雅慧，李林梅，林炳承，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21