一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒DNA含量的检测方法技术

本发明专利技术涉及线性质粒DNA含量的检测方法，包括下述步骤：(1)待测线性质粒DNA样本的纯化；(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；(3)以磷标准物质为标准，以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱‑电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱‑电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。本发明专利技术用分子排阻色谱方法对线性质粒DNA进行纯度分析，可有效的将无机磷、核苷酸、寡聚核苷酸与质粒DNA分离开，可有效排除核苷酸、寡聚核苷酸、无机磷等非质粒DNA来源的磷干扰，保障了基于质粒DNA中磷元素定量的质粒DNA定量的准确可靠。

A detection method of linear plasmid DNA content based on molecular exclusion chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry

The invention relates to a method for detecting the content of linear plasmid DNA, which comprises the following steps: (1) purification of the sample of linear plasmid DNA to be tested; (2) digestion of the method of linear plasmid DNA to be tested that meets the requirements after purity test; (3) mass spectrum peak obtained by the detection of the characteristic value of phosphorus standard substance and the corresponding molecular exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry with the standard substance of phosphorus as the standard substance The area of the linear plasmid DNA sample after digestion was analyzed by molecular exclusion chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry. The corresponding peak area and standard curve of the linear plasmid DNA were used for quantitative analysis. The method of molecular exclusion chromatography for purity analysis of linear plasmid DNA can effectively separate inorganic phosphorus, nucleotide, oligonucleotide and plasmid DNA, effectively eliminate phosphorus interference from non plasmid DNA sources such as nucleotide, oligonucleotide and inorganic phosphorus, and ensure the accuracy and reliability of plasmid DNA quantification based on phosphorus element in plasmid DNA.

【技术实现步骤摘要】
一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒DNA含量的检测方法
本专利技术涉及生物技术产品、生物医药制品、生物诊断试剂等领域，具体地，本专利技术涉及用于质粒DNA含量的检测方法。
技术介绍
准确可靠地定量DNA，在疾病诊断、食品检测和药物质量评价等领域起到至关重要的作用。DNA序列的改变，如DNA甲基化以及染色体的数量变异和结构变异，都与许多疾病的发生发展密切相关。定量研究不仅可以用来对实验结果进行定量，还可以用来检验科学方法及理论的实际应用。目前，常见的DNA定量方法可分为基于紫外吸收的测定或基于荧光的测定两类。紫外吸收光谱，基于DNA链各个碱基单位的假定平均吸光度和分子特征，并且容易受到杂质干扰。实时荧光定量PCR和液滴式数字PCR等是基于荧光的检测方法。qPCR的基础是外部的DNA校准物，标准的可靠性和一致性极大地影响了qPCR量化未知样品的准确性。液滴式数字PCR与qPCR相比具有更高的准确度，但是假阳性信号等问题可能会影响其检测能力。DNA是一种由核苷酸的重复单元构成的长聚合物，其主链由脱氧核糖，碱基和磷酸基团通过酯键连接而成。由于磷酸盐对特定DNA分子的化学计量比固定，使用ICP-MS测定磷含量是精确定量DNA的最有效方法之一，核酸有证标准物质(CRM)的生产需要准确且可追溯的测量，以证明制剂中物质的质量分数。对纯化的DNA进行磷测量并结合使用适当的CRM作为校准物，将为DNA含量的认证提供可追溯的方法。测量核苷酸或DNA的磷含量提供了可溯源至国际单位制(SI)的核酸定量方法，可以评估测量程序每个步骤的总体不确定性的贡献，该方法使测量结果具有长期可比性。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)为测定化学元素提供了一种高度灵敏的方法，已经在单核苷酸和DNA定量分析中有诸多报道，提供了更高的准确度。DNA样本中可能混合含有一些片段DNA和无机磷等成分，需要使用合适的分离技术才能实现DNA定量。分子排阻色谱(SEC)是一种常用的分离分析技术，可用于分离和定量核苷酸及DNA。分子排阻色谱－电感耦合等离子体质谱联用技术(SEC-ICP-MS)是一种非常有效的分离分析技术，具有元素专一性、线性范围宽和检测限低等优点，为快速可靠的多元素形态分析方法的开发提供了很好的基础，在蛋白质、脱氧核苷酸、寡核苷酸杂合物、DNA片段和DNA加合物等的分析检测中有着广泛应用。以前基于同位素稀释质谱的以核苷酸标准为依据的寡聚核苷酸定量，其重要关键步骤是需要将寡聚核苷酸利用核酸酶酶解成单个的脱氧核苷酸或核苷，酶的效率与酶的质量和反应条件密切相关，消解程度不能有效保障，也导致其适用受到明显限制。其重要的缺陷就是不能有效去除外源脱氧核苷酸、脱氧核苷、碱基的影响，导致其适用领域受到明显限制。
技术实现思路
在本专利技术针对现有技术的不足，采用分子排阻色谱来分离质粒DNA，联合电感耦合等离子体质谱技术，研究通过检测质粒DNA中磷含量测量从而定量DNA的方法。本专利技术提供一种线性质粒DNA含量的检测方法，包括下述步骤:(1)待测线性质粒DNA样本的纯化；优选地在所述待测线性质粒DNA样品纯化后对其进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱纯度分析；(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；(3)以磷标准物质为标准，即以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。本专利技术方法实现线性质粒DNA通过分子排阻液相色谱与无机磷、核苷酸、寡聚核苷酸等进行有效分离，即利用分子排阻液相色谱将线性质粒DNA与无机磷，核苷酸、寡聚核苷酸完全分离开来，核苷酸和寡核苷酸也完全分离，核苷酸、寡核苷酸与无机磷也完全分离开来，一方面可以说明线性质粒DNA的纯度，没有核苷酸、寡聚核苷酸等有机磷和无机磷的干扰，另外也为质粒DNA完全消解成无机磷，从而可以利用无机磷标准物质对质粒DNA消解得到的无机磷进行精确定量奠定基础。其中，所述分子排阻色谱分析的条件本领域技术人员可以根据需要来确定，而本专利技术优化的条件为：流动相为含Tris-HCl和EDTA的氯化铵溶液，调pH至7.0-8.0，优选为7.5。流动相采用含Tris-Hcl和EDTA的氯化铵溶液，进而优选采用对应的碱性溶液氨水进行调节pH值，可避免引入其它离子，避免对分子排阻色谱分离质粒DNA造成干扰，而影响洗脱效果和定量分析。根据本专利技术的优选方式，所述分子排阻色谱分析的流动相为0.3M氯化铵含10mMTris-Hcl和1mMEDTA，所述流动相的pH为7.5。进一步地，上样量为10μl，流速为0.5ml/min，柱温为20-30℃,优选为25℃的室温，检测波长260nm，采集时间30min。专利技术人发现，本专利技术的分子排阻色谱分析采用上述上样量、流速、注温、检测波长和采集时间，能够更有效分离质粒DNA，进一步提高质粒DNA定量的准确度。通过上述分子排阻液相色谱分离纯化线性质粒DNA之后，进一步包括电感耦合等立体质谱分析确定待测质粒DNA的纯度，本领域技术人员可以根据需要来确定电感耦合等立体质谱分析条件，而本专利技术优先的条件是：射频发射功率1550W，射频电压1.80V，采样深度8.0mm，雾化气1.0L/min，补偿气35％。更优选地是:四级杆真空度为0.002Pa，雾化室温度为2.0℃，载气流量为1.0L/min，反馈功率为18W，蠕动泵为0.3rps，RF功率为1550W，采样深度为8mm，数据采集模式为TRA，采集时间为20min，积分时间为1.00s。其中，所述的线性质粒DNA消解方法为：将待消解线性质粒DNA分子加入消解罐，加入0.05至0.15倍的过氧化氢，放入密闭容器中，于130至180℃，消解10至18h，优选地加入0.1倍过氧化氢，放入密闭消解罐中，于150℃，消解14h。优选地，第(3)步的具体步骤为:使用磷元素国家标准物质制备浓度梯度工作标准，用分子排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱进行分离分析，以浓度梯度工作标准的质量浓度为横坐标，以质谱峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线，因此标准曲线是磷浓度关于峰面积的线性函数；然后测定消解后的线性质粒DNA的峰面积，通过标准曲线计算磷浓度，核酸的分子量和磷的分子量及磷在核酸中的比值计算质粒DNA的含量。进一步地，其中第(3)步中质粒DNA浓度按下式计算：式中：c—质粒DNA质量浓度；cs—由标准曲线求得样品液中P的质量浓度；f—质粒DNA的稀释倍数；P％—质粒DNA分子中P元素含量百分比。进一步地，线性质粒DNA检测的定量限为17mg/kg，因此采用本专利技术方法时，优选地事先需通过常规方法测定线性质粒DNA的浓度要大于17mg/kg，以确保应用本专利技术方法能够更加准确的进行定量测定。本方法首先用分子排阻色谱方法对通过其他已知方法纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于线性质粒DNA含量的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：/n(1)待测线性质粒DNA样本的纯化，并用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱纯度分析；/n(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；/n(3)以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于线性质粒DNA含量的检测方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)待测线性质粒DNA样本的纯化，并用分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱纯度分析；
(2)将经纯度检测符合要求的待测线性质粒DNA方法进行消解；
(3)以磷标准物质特性量值和相对应的分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱检测得到的质谱峰面积制作标准曲线，然后对消解后的线性质粒DNA样本进行分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析，用得到的线性质粒DNA对应的质谱峰面积和标准曲线进行定量分析。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述分了排阻液相色谱分析的条件是：
流动相为氯化铵，含Tris-Hcl和EDTA，调pH至7.0-8.0，上样量为10μl-20μl，流速为0.4-0.6ml/min，柱温为20-30℃,检测波长260nm，采集时间30min。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述分了排阻液相色谱分析的条件是：
流动相为0.3M氯化铵，含10mMTris-Hcl和1mMEDTA，用氨水溶液调pH至7.5，上样量为10μl，流速为0.5ml/min，柱温为25℃的室温，检测波长260nm，采集时间30min。


4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述电感耦合等立体质谱分析条件是：射频发射功率1550W，射频电压1.80V，采样深度...

【专利技术属性】
技术研发人员：高运华，李春，王志栋，牛春艳，王晶，高颖，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11