一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，由PCR扩增引物、质谱延伸引物、PCR反应缓冲液、dNTP Mix、MgCl

A gene detection kit for hyperphenylalaninemia

The invention discloses a hyperphenylalaninemia gene detection kit, which comprises PCR amplification primer, mass spectrum extension primer, PCR reaction buffer, dNTP mix and MgCl

【技术实现步骤摘要】
一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，尤其涉及一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。
技术介绍
高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏，导致血苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)增高的一组常见的氨基酸代谢病。PAH缺乏症和BH4缺乏症均为常染色体隐性遗传病。正常状况下，天然食物中的蛋白质分解产生的Phe在肝脏PAH的作用下转化成酪氨酸，PAH缺乏可导致HPA，旁路代谢增强，大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸从尿中排出。BH4是PAH、酪氨酸及色氨酸羟化酶的辅酶，BH4缺乏症是由于BH4代谢途径中5种酶中的1种缺乏导致的HPA及神经递质合成障碍，其中6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase，PTPS)缺乏最多见，其次为二氢蝶啶还原酶(dihydropteridinereductase，DHPR)缺乏，鸟苷三磷酸环化水解酶(GTPcyclohydrolase，GTPCH)、墨蝶呤还原酶(sepiapterinreductase，SR)和蝶呤4-α-甲醇氨脱水酶(pterin-4α-carbinolaminedehydratase，PCD)缺乏较少见。据报道，我国256例BH4缺乏症患者中96％为PTPS缺乏，DHPR缺乏占2.4％。1985-2011年我国3500万新生儿筛查资料显示，HPA患病率为1：10397。国际资料报道，高加索人HPA病因中PAH缺乏症占98％，BH4缺乏症约2％。2000-2007年我国新生儿筛查资料显示，HPA中12.9％为BH4缺乏症，以PTPS缺乏最常见，并存在显著的地域差异，南部地区BH4缺乏症发病率较高，台湾发病率最高。PAH缺乏症在新生儿期多无临床症状，出生3～4个月后逐渐表现典型苯丙酮尿症(PKU)的临床特点：头发由黑变黄，皮肤颜色浅淡，尿液、汗液鼠臭味，随着年龄增长，智能发育落后明显、小头畸形、癫痫发作(多表现为痉挛发作)，也可出现行为、性格、神经认知等异常，如多动、自残、攻击、自闭症、自卑、忧郁等。由于症状缺乏特异性，临床诊断困难，易被误诊为脑性瘫痪、癫痫等神经系统疾病，需要依靠生化分析进行病因诊断。BH4缺乏症患儿除表现PKU症状外，主要表现为躯干肌张力低下，四肢肌张力增高或低下，如吞咽困难、口水增多、松软、角弓反张等。PAH缺乏症和BH4缺乏症的病因和发病机制明确，是一种可以治疗的遗传病，基因诊断是HPA的确诊方法。患儿通过早期诊断并采用饮食控制或药物治疗方法可有效阻断病程发展，有希望像正常孩子一样成长。因此，患儿的早期检出和治疗是非常必要的，通过对PAH和BH4相关基因检测进行疾病筛查和诊断是解决该问题的重要手段。现有的基因检测方法主要包括聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)，聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)，聚合酶链-短重复序列多态分析(PCR-STR)，Sanger测序，高分辨率熔解曲线法，微型DNA芯片，二代测序技术等。以上技术应用于PAH缺乏症和BH4缺乏症基因检测，都难以使检测通量和成本达到有效的平衡，而且大部分方法都存在检测的基因位点有限，增加了漏检的可能性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，是一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒。本专利技术的试剂盒，由PCR扩增引物、质谱延伸引物、10×PCR反应缓冲液、dNTPMix(25mM)、MgCl2(25mM)、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTerminationMix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，其中：PCR扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.90所述；质谱延伸引物序列如SEQIDNO.91～SEQIDNO.135所示。所述的PCR扩增引物包含2管扩增引物混合物；所述的质谱延伸引物包含2管延伸引物混合物。扩增引物混合物：第1管的扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.46所示，第2管的扩增引物序列如SEQIDNO.47～SEQIDNO.90所示。延伸引物混合物：第1管的延伸引物序列如SEQIDNO.91～SEQIDNO.113所示，第2管的延伸引物序列如SEQIDNO.114～SEQIDNO.135所示。本专利技术提供的一种基于MassARRAY质谱平台的高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，能检测45种HPA基因变异位点，包括如下步骤：(1)设计扩增引物：本专利技术的扩增引物由SEQIDNO.1～SEQIDNO.90组成。(2)设计延伸引物：本专利技术的延伸引物由SEQIDNO.91～SEQIDNO.135组成。(3)检测模板的制备：提取待测样本DNA(4)以步骤(3)中提取的DNA为模板，利用步骤(1)中的2管扩增引物混合物分别进行PCR扩增，获得靶序列的PCR产物。(5)SAP酶处理，除去步骤(4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP。(6)以步骤(5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤(2)中的延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。采用树脂纯化步骤(6)中获得的延伸产物。采用飞行时间质谱基因分型系统对纯化产物进行扫描、检测，检测结果使用TYPER4.0软件分型并输出结果，通过质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否突变。本专利技术试剂盒能检测苯丙酮尿症45种热点基因变异位点，其中包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点。通过使用如SEQIDNO.1～SEQIDNO.90所示的扩增产物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQIDNO.91～SEQIDNO.135所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物经纯化后进行MassARRAY质谱平台分析。本专利技术试剂盒，检测基因位点覆盖度高，高通量，用时短，低成本，高准确性。因此，该试剂盒应用潜力大，实用性强。本方法能检测45种HPA的热点基因变异位点，包括PAH基因39种变异位点，PTS基因6种变异位点，基因检测位点的高覆盖度有利于提升疾病筛查的检出率。基于MassARRAY质谱平台的检测技术可同时检测多种突变位点，实验设计灵活，检测方法简便，可提高疾病的检出率，同时还具有高通量、低成本的特点。附图说明图1表示以临床样本提取的DNA为模板，进行检测的质谱峰图，分析起峰在分子质量为6252.1Da的G峰位置和6236.1Da的A峰位置，此数据表明该样本为纯合A，为PAHc.728G>A野生纯合型样本的质谱峰图结果。图2表示以临床样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物、质谱延伸引物、10×PCR反应缓冲液、dNTP Mix、MgCl

【技术特征摘要】
1.一种高苯丙氨酸血症基因检测试剂盒，其特征在于：由PCR扩增引物、质谱延伸引物、10×PCR反应缓冲液、dNTPMix、MgCl2、PCR反应Taq酶、SAP反应缓冲液、SAP酶、iPlex反应缓冲液、iPlexTerminationMix、Extension反应Taq酶、MassARRAY芯片组成，其中：PCR扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.90所示，质谱延伸引物序列如SEQIDNO.91～SEQIDNO.135所示。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增引物包含2管扩增引物混合物；所述的延伸引物包含2管延伸引物混合物；
扩增引物混合物：第1管的扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.46所示，第2管的扩增引物序列如SEQIDNO.47～SEQIDNO.90所示；
延伸引物混合物：第1管的延伸引物序列如SEQIDNO.91～SEQIDNO.113所示，第2管的延伸引物序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新文，张玉，杨建滨，沈亚平，朱琳，胡真真，张婷，林建兴，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33