紫铆因在制备靶向恢复突变p53构象药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了紫铆因在制备靶向恢复突变p53构象药物中的应用，本发明专利技术实验结果显示：化合物Butein可以降低突变p53的表达，增加突变p53背景下肿瘤细胞中野生型p53的表达，上调p53下游靶基因

The application of purple riveting in the preparation of targeted recovery mutant p53 conformational drugs

The invention discloses the application of purple riveting in the preparation of targeted recovery mutant p53 conformational drugs. The experimental results of the invention show that compound butein can reduce the expression of mutant p53, increase the expression of wild-type p53 in tumor cells under the background of mutant p53, and up regulate the downstream target gene of p53

【技术实现步骤摘要】
紫铆因在制备靶向恢复突变p53构象药物中的应用
本专利技术属于医药领域，涉及紫铆因在恢复突变p53构象药物中的应用。
技术介绍
p53作为已有大量的研究证实突变p53可以作为药物的靶点，主要的方案包括诱导突变型p53蛋白的降解或在肿瘤细胞中重新激活野生型p53，使突变p53恢复野生型p53抑癌功能，靶向突变p53的另一策略是开发能在肿瘤细胞内重建p53蛋白功能的小分子化合物，使突变蛋白改变构象，恢复其转录激活功能，从而恢复其抑癌功能。一些天然产物被发现具有靶向突变p53的作用，紫铆因（Butein）又称紫铆花素，其化学名称为2,3,4,4’-四羟基查尔酮（2,3,4,4’-tetrahydroxychaleo），是一个查尔酮类化合物，属于植物多酚类物质，为腰果树（Semecarpusanacardium）的茎皮、黄檀属（Dalbergiaodorifera）的心皮、传统中草药本草锦鸡属（Caraganajubata）以及漆树（Rhusverniciflua）的茎的主要活性成分。目前，有研究表明：紫铆因可以抑制糖尿病综合征和降血压；可以减少抗体相关的肾小球炎的发生；可以抑制由四氯化碳诱导的肝纤维化；可以改善由顺铂诱导的急性肾功能衰竭，提高肾的浓缩功能。在体内外试验中报道：紫铆因能够抑制多种人类肿瘤细胞的增殖，包括乳腺癌，肺癌，淋巴癌，骨肉瘤和黑色素瘤等，具有广泛的生物学活性。如：通过自噬途径促进骨肉瘤细胞发生凋亡；通过激活AMPK/FOXO3a信号通路抑制食管癌EC109细胞的增殖、迁移能力，激活氧化应激，促进细胞凋亡；通过抑制VEGF受体2(VEGFR2)介导的Akt-mTOR-S6信号通路和FAK、ERK1/2等蛋白的磷酸化修饰而抑制血管新生，进而抑制肿瘤生长。目前，紫铆因在靶向突变p53的作用尚未见报道。
技术实现思路
为了拓展查尔酮类化合物应用的新领域，本专利技术的目的在于开发查尔酮类化合物紫铆因作为一种靶向恢复突变p53的天然药物，其作用主要是：1）将突变p53恢复转变为野生型构象，从而恢复其抑癌功能；2）通过降解突变p53从而抑制肿瘤细胞生长进程。本专利技术目的是提供一种药物组合物，含有有效量的查尔酮类化合物紫铆因和药学上可接受的载体。本专利技术另一目的是将紫铆因应用在制备靶向抗肿瘤药物中。本专利技术化合物可以通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者；用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、滴丸、微丸、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、口服溶液、糖浆剂或酏剂；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。本专利技术是将查尔酮类化合物紫铆因作为有效活性成分，可进一步制成口服或注射制剂，其中可添加一种或多种药物上可接受的辅料以改善衍生产品的吸收效果或便于服用，所述的辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。本专利技术靶向筛选体系通过DNA重组技术基础，将PUMA启动子序列插入双报告基因载体PEZX-GA01的GLuc报告基因上游，并经脂质体转染法得到稳定表达PUMA启动子荧光素酶报告基因系统的H1299P53R175H/P53R273H细胞，通过检测化合物对该细胞中报告基因的表达影响，可以表征转录因子p53与靶基因PUMA启动子的结合情况，进而作为mutp53重激活剂初筛的依据，从而用于肿瘤药物的高通量、快速靶向筛选；初步发现紫铆因（Butein）与PRIMA-1(已经被证实可以恢复突变p53的野生型功能)作用类似，可以增加其PUMA启动子的相对荧光素酶活；随后，我们通过westernblotting，证实，Butein可以降低p53的蛋白表达，采用免疫荧光和免疫沉淀试验，分别用PAb1620(识别野生型p53)和PAb240（识别突变型p53），实验结果显示：在药物处理后，突变p53降低，而野生型p53增加；从以上结果显示：提示Butein可以恢复突变p53构象以及降解突变p53，这为天然产物肿瘤治疗提供新的作用靶点，也为肿瘤治疗提供了新的策略。附图说明图1是化合物Butein处理H1299p53R175H/p53R273H-PUMApromoterBS2细胞24小时后相对荧光素酶活表达结果；其中A图为H1299p53R175H-PUMApromoterBS2细胞，B图为H1299p53R273H-PUMApromoterBS2细胞；图2是化合物Butein处理HT29、SK-BR-3细胞12、24、48小时后p53以及下游靶基因的蛋白表达结果；其中A图为HT29，B图为SK-BR-3细胞；图3是化合物Butein处理HT29、SK-BR-3细胞48小时后，野生型p53与突变型p53的表达结果。图是免疫沉淀试验结果；其中上图为HT29，下图为SK-BR-3细胞；图4是化合物Butein处理HT29、SK-BR-3细胞48小时后，野生型p53与突变型p53的表达结果。图是免疫荧光试验结果，其中A图为HT29，B图为SK-BR-3细胞。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。实施例1：mutp53重激活剂筛选1、取生长良好，汇合度80-90%的H1299p53R175H/p53R273H-PUMApromoterBS2细胞（稳定表达PUMA启动子荧光素酶报告基因），按1.5×105个细胞/孔接种至6孔板中，晃匀，放入37℃培养箱孵育24h至细胞贴璧完全；2、将贴璧完全的H1299p53R175H/p53R273H-PUMApromoterBS2细胞从培养箱取出，吸掉旧培养基，加入2mL含相应工作浓度化合物的新鲜RPMI1640培养基，晃匀，放入37℃培养箱孵育15h；3、GLuc、SEAP都属于分泌型的蛋白，因此化合物处理完毕后，可轻轻收集细胞培养上清，立即检测GLuc、SEAP的活性；A、检测GLuc的活性（1）收集化合物处理完毕的100μL细胞培养上清至1.5mL离心管，然后置于室温；（2）将10×的GL-S缓冲液取出并在常温下解冻，充分混匀后取适量10×的GL-S缓冲液用超纯水稀释为1×GL-S缓冲液。1×GL-S缓冲液用量为100μL/反应；（3）避光环境下，往1×GL-S缓冲液加入1/100总体积的SubstrateGL(100×)，充分混匀，配得GLuc工作液；（4）将待检测上清及GLuc工作液分别移入25℃杂交炉中温育25分钟；（5）取一个干净的不透光96孔酶标板，将温育完毕的上清及工作液取出分别移取10，100μL至孔中，用移液枪混和均匀；（6）混匀完毕后，96孔板放入25℃杂交炉孵育1分钟，然后将酶标仪的读板模式设置为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.紫铆因在制备靶向恢复突变p53构象药物中应用。/n

【技术特征摘要】
1.紫铆因在制备靶向恢复突变p53构象药物中应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：紫铆因作为靶向恢复突变p53构象药物，使突...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继虹，宋斌，罗瑛，苏永南，刘静，盛苗苗，谢晓丽，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53