一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域，本发明专利技术基于酶蛋白结构分析，设计及构建酶突变库，筛选获得对有机溶剂耐受性增强的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的毕赤酵母工程菌，该有机溶剂耐受性增强的脂肪酶突变体，相对于野生型在对耐受有机溶剂的能力显著增强，在50％的乙醇处理2小时，其残余活力仍保留是75％，约为是野生型的3倍；该脂肪酶突变体可在生物柴油及风味酯制备加工过程中应用，具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长，节约生产成本和提高生产效率。

An organic solvent tolerant lipase mutant and its application

The invention discloses an organic solvent tolerant lipase mutant and its application, belonging to the field of gene engineering and enzyme engineering technology. Based on the analysis of enzyme protein structure, the invention designs and constructs an enzyme mutation library, selects and obtains lipase mutants with enhanced tolerance to organic solvents, and constructs a Pichia pastoris engineering strain with high-efficiency expression of the mutant. The organic solvent tolerance Compared with the wild-type, the enhanced lipase mutant can significantly enhance its ability to withstand organic solvents. After being treated with 50% ethanol for 2 hours, its residual activity is still 75%, which is about 3 times of that of the wild-type. The lipase mutant can be applied in the preparation and processing of biodiesel and flavor esters, with good stability, long life and life saving in the application process Production cost and improve production efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用
本专利技术涉及基因工程及酶工程领域，特别是涉及一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用。
技术介绍
脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构(Schmid等,1998)。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。脂肪酶在水环境中能够催化酯键的水解，当处于有机溶剂环境中能催化酯交换，酯化，醇解，酸解等反应。而脂肪酶作用的底物往往是水不溶性的，在有机相中才有较好的溶解度，但是在有机溶剂中，大多数酶类活力受到抑制甚至失活，所以其在生物催化中的应用受到很大限制。在有机介质中维持较高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的广泛性是实际生物催化过程中的难题。因此开发耐有机溶剂脂肪酶在理论和工业应用上具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该脂肪酶突变体可应用于风味酯的合成及生物柴油的生产，其具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长，节约生产成本和提高生产效率。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体，所述有机溶剂耐受的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQIDNO.1的脂肪酶的第191位氨基酸由Arg变为Ala。上述有机溶剂耐受的脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。上述有机溶剂耐受的脂肪酶突变体的编码基因的核酸序列为SEQIDNO.3。本专利技术还提供一种在宿主细胞内表达氨基酸序列为SEQIDNO.2的有机溶剂耐受的脂肪酶突变体的重组质粒。进一步地，所述重组质粒含有序列为SEQIDNO.3的核酸。本专利技术还提供一种工程菌株，所述工程菌含有在宿主细胞内表达氨基酸序列为SEQIDNO.2的有机溶剂耐受的脂肪酶突变体的重组质粒或含有核酸序列为SEQIDNO.3的重组质粒。进一步地，所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。本专利技术还提供上述的有机溶剂耐受的脂肪酶突变体、上述的重组质粒、上述的工程菌株在风味酯物质及生物柴油合成中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术基于酶蛋白结构分析，设计及构建酶突变库，筛选获得对有机溶剂耐受性增强的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的毕赤酵母工程菌，该有机溶剂耐受性增强的脂肪酶突变体，相对于野生型在对耐受有机溶剂的能力显著增强，在50％的乙醇处理2小时，其残余活力仍保留75％，约为是野生型的3倍；该脂肪酶突变体可在生物柴油及风味酯制备加工过程中应用，具有良好的稳定性能，可在应用过程中寿命延长，节约生产成本和提高生产效率。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例3有机溶剂耐受脂肪酶突变体的筛选酶活对比图；图2为实施例3中R191A突变体在不同溶剂中耐受能力对比图；图3为实施例5的MAS1及R191A突变体合成己酸乙酯的合成效率对比图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。实施例1突变体表达载体的构建根据Stratagene公司的QuikChange方案，在QuikChange引物设计网站(http：//www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp)设计了突变体R191A、Q201A、V203A、V199F、H139R、V48D及P252D引物。采取的定点突变(QuikChangeSite-directedMutagenesis)中对脂肪酶MAS1基因进行定点突变。具体如表1所示：表1脂肪酶基因定点突变的反应体系PCR反应条件为：98℃预变性3min；94℃变性10s，68℃延伸4min，20个循环；72℃7min。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检验。PCR产物经检测确认后，加入DpnI处理去除带甲基化的原始模板链。酶切体系如下：酶切反应条件：37℃，1h。将酶切产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂布在含Amp的LB平板，在37℃恒温培养箱中过夜培养。挑取单克隆接种于5mL的LB培养基中，在37℃下过夜培养，提取质粒进行基因序列测定。实施例2突变体酶蛋白制备与纯化将含有MAS1脂肪酶(氨基酸序列为SEQIDNO：1)及其突变体基因的pET22b表达载体转化到BL21(DE3)菌种中，并进行诱导表达：(1)接种200μL阳性克隆子甘油菌到50mL低盐LB(含100μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm过夜培养15～18h。(2)按2％接种量将种子液接种到500mLLB(含100μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm培养OD600至0.6～0.8，然后加入1MIPTG溶液至IPTG终浓度为0.4mM，15℃、200rpm诱导培养18h。诱导结束后进行重组蛋白的纯化：(1)收菌：将菌液置于冰上预冷约15min，然后于4℃、10000rpm条件下离心10min，弃上清。(2)破菌收集上清：用预冷的PBS溶液重悬细胞，超声破碎15m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体，其特征在于，所述有机溶剂耐受的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的脂肪酶的第191位氨基酸由Arg变为Ala。/n

【技术特征摘要】
1.一种有机溶剂耐受的脂肪酶突变体，其特征在于，所述有机溶剂耐受的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQIDNO.1的脂肪酶的第191位氨基酸由Arg变为Ala。


2.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受的脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。


3.根据权利要求1所述的有机溶剂耐受的脂肪酶突变体，其特征在于，其编码基因的核酸序列为SEQIDNO.3。


4.一种重组质粒，其特征在于，其用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的有机溶剂耐受的脂肪酶突...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永华，蓝东明，赵泽鑫，杨博，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44