一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养的方法，具体公开了一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，旨在解决现有技术叶片愈伤组织诱导过程中外植体褐变的技术问题。本发明专利技术的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法为对外植体预处理和消毒、外植体茎段诱芽培养、外植体叶片愈伤组织诱导和外植体叶片愈伤组织增殖，所述外植体茎段诱芽培养操作所使用的茎段芽诱导培养基为：MS、1.5mg/L 6‑BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。本发明专利技术提高了玉郎伞叶片诱导愈伤组织的成功率和茎段初步诱导生芽，为下一步的诱芽分化提供材料，促进玉郎伞组织培养快速繁殖体系的建立。

A method of callus and bud induction in the primary generation of Cymbidium yulangensis

The invention relates to a method for plant tissue culture, in particular to a method for callus induction and bud induction of Yulangsan primary generation, aiming to solve the technical problem of explant browning in the process of leaf callus induction of the prior art. The primary callus and bud induction method of Yulangsan is the pretreatment and disinfection of explants, the shoot induction culture of explants, the callus induction of explants leaves and the callus proliferation of explants leaves. The shoot induction culture medium used in the shoot induction operation of explants is MS, 1.5mg/l 6 \u2011 Ba, 0.1mg/l NAA, 30g / l sucrose and 6G / L agar, with a pH of 5.8 \u3002 The invention improves the success rate of callus induction of Yulangsan leaves and bud induction of stem segments, provides materials for bud induction and differentiation in the next step, and promotes the establishment of rapid propagation system of Yulangsan tissue culture.

【技术实现步骤摘要】
一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法
本专利技术涉及植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法。
技术介绍
玉郎伞是豆科蝶型花亚科植物疏叶崖豆的块根，又称小牛力、龙眼参、土甘草等，一般生长于山坡、荒地并且阳光充足的地方，主要分布于广西和广东等地。玉郎伞为广西壮、瑶医常用药材，用干燥块根入药，具有抗炎、抗肿瘤、降低血压、扩张血管、保肝及抗自由基、补气、补血、提高机体免疫力等作用，用于治疗小儿疳积、血虚头晕、失眠、骨折、中风性偏瘫等疾病，也可用于治疗高血压、老年健忘、体弱多病及病后、产后虚弱等。见于《广西中药志》、《广西民族药简编》、《湖南药物志》、《广西壮族自治区壮药质量标准(第一卷)》(2008年版)等。随着近年来研究玉郎伞的药用功能逐渐被挖掘，野生玉郎伞资源被利用了很大部分，其次，玉郎伞从人工种植到收获需五年以上，导致出现供求赶不上日渐增长的需要的现象。目前，玉郎伞的来源主要是人工繁殖和野生资源，人工繁殖主要有块根无性繁殖和种子繁殖，容易受到自然环境的影响目前的繁殖方法存在叶片愈伤组织诱导褐变问题，而且茎段诱导长芽存在的局限性，灵活性不高。其次，据相关报道，目前有关玉郎伞组织繁殖的研究很少。本专利技术进一步推动玉郎伞的组织快繁进程，满足市场上的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为克服现有技术的不足，提供一种能克服叶片愈伤组织诱导过程中外植体褐变，提高玉郎伞叶片诱导愈伤组织的成功率和茎段初步诱导生芽的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，为下一步的诱芽分化提供材料，促进玉郎伞组织培养快速繁殖体系的建立。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供的技术方案为：一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，包括如下步骤：对外植体预处理和消毒、外植体茎段诱芽培养、外植体叶片愈伤组织诱导和外植体叶片愈伤组织增殖；所述外植体茎段诱芽培养操作所使用的茎段芽诱导培养基为：MS、1.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述外植体叶片愈伤组织诱导操作所使用的叶片愈伤组织诱导培养基为：MS、1.0mg/L2,4-D、1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述的外植体叶片愈伤组织增殖操作所使用的叶片愈伤组织增殖培养基为：MS、0.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、0.1mg/LKT、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，pH为5.8。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述外植体茎段诱芽培养、外植体叶片愈伤组织诱导和外植体叶片愈伤组织增殖的培养条件均为：培养温度控制在(25±2)℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述外植体预处理和消毒的方法是将外植体经过高温高压灭菌，然后依次用酒精、无菌水和汞消毒冲洗。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述外植体茎段诱芽培养时将消毒后的外植体茎段去掉顶端和尾部，切割成带两个节点的茎段接种到茎段芽诱导培养基中。在上述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法中，所述外植体叶片愈伤组织诱导时将消毒后的外植体叶片剪成块状，叶背向上接入培养。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1.本专利技术通过对玉郎伞叶片的初代愈伤组织诱导培养，解决由因叶片诱导带来的褐变问题，操作简单，促进玉郎伞组织培养快速繁殖体系的建立，从而满足市场上对玉郎伞药材的需求。2.本专利技术通过对玉郎伞茎段的初代诱芽培养方法的研究，具有不同于以往的诱芽条件的特点，可以进一步减小玉郎伞在组织快繁方面的局限性。附图说明下面结合附图中的具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。图1为无病害的玉郎伞植株；图2为采集前的外植体；图3为本专利技术的前期茎段诱芽培养基下长出的芽；图4为本专利技术的后期茎段诱芽培养基下长出的芽；图5为对比例1茎段诱芽培养基下长出的芽；图6为对比例2茎段诱芽培养基下长出的芽；图7为本专利技术叶片愈伤组织诱导培养基所诱导生成的愈伤组织；图8为对比例2叶片愈伤组织诱导培养基所诱导生成的愈伤组织；图9为本专利技术叶片愈伤组织增殖培养基所生成的愈伤组织；图10为对比例1叶片愈伤组织增殖培养基所生成的愈伤组织。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本专利技术的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1(1)外植体的预处理和消毒：将当天采集的无病害外植体置于培养瓶中，放入洗衣粉，震荡1min后用清水冲洗1h，后将其放入超净工作台上经过高温高压灭菌的瓶子内，用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗5次。然后用无菌吸水纸吸干表面水分，经过剪切接进诱导培养基中。(2)茎段芽诱导：将消毒后的外植体茎段用无菌吸水纸吸干表面水分，用无菌剪刀将茎段去掉顶端和尾部，切割成带两个节点的茎段接种到芽诱导培养基中置于培养温度控制在(25±2)℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d条件下进行培养。茎段在15天后，长出较多腋芽，每个茎段诱导出1-2个芽，腋芽长势较好，无褐化现象。所述的茎段芽诱导培养基为：MS、1.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，pH为5.8。(3)叶片愈伤组织诱导：将消毒后的外植体叶片用无菌吸水纸吸干表面水分，用无菌剪刀去掉叶子边缘，将叶子剪成约1cm*1cm大小的块状，叶背向上接到愈伤组织诱导中置于培养温度控制在(25±2)℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d条件下进行培养。叶片在10天左右长出愈伤组织，叶片皱缩，在叶脉及边缘长出愈伤组织，呈淡黄色并泛绿，褐化率低。所述的叶片愈伤组织诱导培养基为：MS、1.0mg/L2,4-D、1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，pH为5.8。(4)叶片愈伤组织增殖：将步骤(3)得到初代愈伤组织接到增殖培养基中置于培养温度控制在(25±2)℃，光照强度为1500-2000lx，光照时间为12h/d条件下进行培养。愈伤组织呈黄色或淡黄色，增殖效果好，无褐化现象。所述的叶片愈伤组织增殖培养基为：MS、0.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、0.1mg/LKT、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，pH为5.8。对比例1(1)外植体的预处理和消毒：将当天采集的无病害外植体置于培养瓶中，放入洗衣粉，震荡1min后用清水冲洗1h，后将其放入超净工作台上经过高温高压灭菌的瓶子内，用75％酒精消毒1min,无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞消毒9min,无菌水冲洗5次。然后用无菌吸水纸吸干表面水分，经过剪切接进诱导培养基中。...

【技术保护点】
1.一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：对外植体预处理和消毒、外植体茎段诱芽培养、外植体叶片愈伤组织诱导和外植体叶片愈伤组织增殖；/n所述外植体茎段诱芽培养操作所使用的茎段芽诱导培养基为：MS、1.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。/n

【技术特征摘要】
1.一种玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：对外植体预处理和消毒、外植体茎段诱芽培养、外植体叶片愈伤组织诱导和外植体叶片愈伤组织增殖；
所述外植体茎段诱芽培养操作所使用的茎段芽诱导培养基为：MS、1.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。


2.根据权利要求1所述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，其特征在于，所述外植体叶片愈伤组织诱导操作所使用的叶片愈伤组织诱导培养基为：MS、1.0mg/L2,4-D、1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH为5.8。


3.根据权利要求1或2所述的玉郎伞初代愈伤组织和芽诱导方法，其特征在于，所述的外植体叶片愈伤组织增殖操作所使用的叶片愈伤组织增殖培养基为：MS、0.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA、0.1mg/LKT、30g/L蔗糖、6...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢海啸，周夏艳，陈晴晴，梁晶晶，高日芳，董燕平，
申请(专利权)人：玉林师范学院，
类型：发明
国别省市：广西;45