通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其C制造技术

描述了基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的LeuCD'酶复合物制备C

Preparation of elongated 2-ketoacids and their C by gene modification of microbial metabolic pathway

The modified leucd 'enzyme complex was described, and C was prepared by the modified leucd' enzyme complex

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其C5-C10化合物的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年9月30日提交的美国临时申请序列号62/402,586和2016年9月30日提交的美国临时申请序列号62/402,569的权益，这两个申请通过引用整体并入本文。序列表该申请通过引用并入2016年8月23日创建并且在2016年9月30日于美国临时申请序列号62/402,569中提交的94,000字节的ASCII文本文件“79046-WO-PCT_SequenceListing.txt”中的材料。
本公开一般涉及基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的LeuCD'酶复合物制备C7-C112-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物。
技术介绍
对获得和使用化石燃料的未来稀缺性、成本和环境影响的担忧刺激了人们开发廉价可再生生物质作为燃料和由其制造的化学品的替代来源。随着原油价格的上涨，生物基化学品和工业产品已成为其石油衍生产品的有吸引力的替代品。使用厌氧微生物的发酵过程为将生物质和农业废物转化为有用产品提供了有希望的途径，同时解决了处理低价值农产品和食品加工副产品/废物时可能遇到的问题。可由低成本生物质原料制备的一些有用产品是C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸和C5-C9烷烃，包括特别是C6-C10醇。C6-C10醇使用石油化学和天然原料方法生产。石油化学方法基于乙烯低聚反应。例如，齐格勒法在高压下使用铝介导乙烯低聚反应以产生三烷基铝形态。三烷基铝形态在干燥空气下氧化并水解，得到末端醇的泊松分布，其长度范围为C2-C26(仅包括偶数碳链原子)。通过乙烯低聚反应，例如通过Shell高级烯烃方法(即SHOP)产生烯烃的加氢甲酰化，然后还原产生具有奇数碳链原子的醇。天然油(比如，例如棕榈仁和椰子)的脂肪酸通过氢化、酯交换和还原的油脂化学转换的转化也用于产生长链醇，其中大部分醇的碳链长度大于C10。当前生产方法的显著缺点是对窄碳链长度分布缺乏选择性。此外，齐格勒法也不是完美的，因为其副产物是水合氧化铝(即Al2O3·[H2O]x)。因此，需要鉴定产生C6-C10醇、C5-C9烷烃和C6-C10羧酸的更好和更便宜的方法。然而，微生物有机体经常无法以经济上可行的速率或产率生产许多基于石油化学的产品。例如，虽然代谢工程已被广泛用于构建途径和/或将代谢物通向感兴趣的途径，但乙醇是目前使用微生物有机体产生的最常见的生物化学品。在生物燃料和化学工业中，正在积极地寻求经济上可行的生产C6-C10醇和C6-C10羧酸的方法。通过微生物发酵成功生产天然氨基酸已经引起了对利用氨基酸生物合成途径生产目标化学品(包括较长链醇、烷烃和羧酸)的显著兴趣。特别感兴趣的是2-酮酸，其为氨基酸生物合成中的关键中间体，可用于细胞内化学物质的生物合成。亮氨酸生物合成途径中的三种酶参与延长2-酮酸，并且可以将2-酮丁酸、2-酮异戊酸和/或2-甲基-2-酮戊酸转化为更长链的2-酮酸。这些酶通常被称为异丙基苹果酸合成酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶，而不涉及任何特定的微生物有机体。具体而言，在大肠杆菌中，这些酶分别被称为LeuA(GenBank：登录号NC000913.3基因ID：947465)、LeuB(GenBank：登录号NC000913.3基因ID：944798)和LeuCD(GenBank：登录号NC000913.3基因ID：945076和基因ID：945642)。通过大肠杆菌的LeuA基因产物的工程化延长细胞内2-酮酸的长度的可行性扩大了可以由2-酮酸产生的生物化学物质的范围。在大肠杆菌中，LeuABCD基因的产物将2-酮酸的长度延长一个碳单位。在亮氨酸生物合成期间观察到这种延长，其中LeuABCD基因的产物共同作用以将2-酮异戊酸(5-碳酸)转化为2-酮异己酸(6-碳酸)。此外，LeuA活性位点的扩增允许将C4酮酸、2-丁酮酸(即2-酮丁酸)递归延长至C92-酮酸、2-酮壬酸(即2-酮壬酸)。然而，需要继续开发LeuABCD基因和使其工程化以允许有效产生C7-C112-酮酸并避免在用于延长2-酮酸的途径的后期阶段中的主要瓶颈。因此，持续需要用于生产更长链醛、烷烃、醇和羧酸的经济上可行且有效的方法。
技术实现思路
本公开的实施例通过提供基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的LeuCD'酶复合物制备C7-C112-酮酸的方法以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体来满足那些需要。基因修饰的LeuCD'酶复合物，制备C7-C112-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于生产生物基化学品和工业产品作为化石燃料的替代品。本专利技术公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物，制备C7-C112-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于在体内和体外生产更长链的醛、烷烃、醇和羧酸。根据本公开的实施例，提供了LeuCD'酶复合物。LeuCD'酶复合物包括：(a)LeuC亚基和(b)LeuD亚基。LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。LeuD亚基(b)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQIDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuD亚基，其包括与SEQIDNO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。LeuCD'酶复合物包括(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b)(1)的组合，并且基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。根据本公开的其他实施例，提供了用于制备C7-C112-酮酸的方法。该方法包括在将C4-C102-酮酸底物中的至少一种转化为C7-C112-酮酸的条件下，提供C4-C102-酮酸底物中的至少一种与(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶，(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶，和(C)至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物。基因修饰的LeuCD'酶复合物包括(1)LeuC亚基和(2)LeuD亚基。LeuC亚基(1)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。LeuD亚基(2)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuD亚基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备C

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20160930 US 62/402569;20160930 US 62/4025861.一种制备C7-C112-酮酸的方法，所述方法包括：(I)提供C4-C102-酮酸底物中的至少一种与
(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶；
(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；和
(C)至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物，其包括：
(1)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：
(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和
(2)LeuD亚基，其选自由以下组成的群组：
(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQIDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(ii)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQIDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合；
在所述C4-C102-酮酸底物中的至少一种转化为所述C7-C112-酮酸的条件下；
其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(2)(ii)的组合、(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(ii)的组合、或(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(i)的组合；其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性；以及其中所述C4-C102-酮酸底物中的至少一种通过一种或多种生化反应转化为所述C7-C112-酮酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(a)丙氨酸取代Val-35；
(b)甘氨酸取代Val-35；
(c)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；
(d)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；
(e)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及
(f)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。


3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(a)丙氨酸取代Leu-31；
(b)甘氨酸取代Leu-31；
(c)缬氨酸取代Leu-31；
(d)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；
(e)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；
(f)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及
(g)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(1)(ii)的组合，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C102-酮酸底物中的至少一种包含2-酮丁酸。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C102-酮酸底物中的至少一种包含2-酮异戊酸。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C202-酮酸底物中的至少一种包含2-甲基-2-酮戊酸。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：(II)在所述C7-C112-酮酸被转化为比被转化的所述C7-C112-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向所述C7-C112-酮酸提供至少一种具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶。


11.根据权利要求10所述的方法，其还包括：(III)在所述C6-C10醛被转化为相应的C6-C10醇的条件下，向所述C6-C10醛提供至少一种具有醇脱氢酶活性的醇脱氢酶。


12.根据权利要求10或11所述的方法，其还包括：(III)在C6-C10醛被转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向C6-C10醛提供至少一种具有醛脱氢酶活性的醛脱氢酶。


13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其还包括：(III)在所述C6-C10醛被转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向所述C6-C10醛提供至少一种具有脂肪醛脱羰酶活性的脂肪醛脱羰酶。


14.一种微生物有机体，其包括：
一种基因修饰的LeuCD'酶复合物，其包括：
(a)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：
(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQIDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·桑格哈尼，E·薛，S·格林华特，P·博萨莱，S·德拉普兰，C·斯托尔斯，
申请(专利权)人：陶氏环球技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US