异佛尔酮的区域选择性羟基化和朝向氧代异佛尔酮的进一步转换制造技术

本发明专利技术涉及经由异佛尔酮的生物催化转换来产生氧代异佛尔酮的新方法，特别是用于在两步氧化方法中转换α‑异佛尔酮的一锅生物催化体系，其中第一氧化由含有血红素的氧化还原酶(诸如细胞色素P450单加氧酶)催化，之后是另一氧化，所述另一氧化可以是化学反应或生物催化反应，特别地其中所述氧化由NAD(P)或NADP(H)依赖性氧化还原酶催化。本发明专利技术还提供了编码与野生型酶相比具有改良的(更高的)底物选择性、总周转数和/或活性(反应性)的细胞色素P450单加氧酶的多肽和核酸序列。氧代异佛尔酮可用作维生素和类胡萝卜素合成中的结构单元。

Regioselective hydroxylation of Isophorone and its further conversion to oxyisophorone

The invention relates to a new method for producing oxyisophorone via the biocatalytic conversion of Isophorone, in particular to a pot biocatalytic system for converting \u03b1 - isophorone in a two-step oxidation method, wherein the first oxidation is catalyzed by an oxidoreductase (such as cytochrome P450 monooxygenase) containing heme, followed by another oxidation, wherein the other oxidation can be a chemical reaction Should or biocatalytic reactions, in particular where the oxidation is catalyzed by NAD (P) or NADP (H) - dependent oxidoreductase. The invention also provides polypeptide and nucleic acid sequences encoding cytochrome P450 monooxygenase with improved (higher) substrate selectivity, total cycle number and / or activity (reactivity) compared with wild-type enzyme. Oxyisophorone can be used as a structural unit in the synthesis of vitamins and carotenoids.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】异佛尔酮的区域选择性羟基化和朝向氧代异佛尔酮的进一步转换本专利技术涉及经由异佛尔酮的生物催化转换来产生氧代异佛尔酮(ketoisophorone)的新方法，特别是用于在两步氧化方法中转换α-异佛尔酮的一锅(one-pot)生物催化体系，其中第一氧化由含有血红素的氧化还原酶(诸如细胞色素P450单加氧酶)催化，之后是另一氧化，所述另一氧化可以是化学反应或生物催化反应，特别地其中所述氧化由NAD(P)或NADP(H)依赖性氧化还原酶催化。本专利技术还提供了编码与野生型酶相比具有改良的(更高的)底物选择性、总周转数和/或活性(反应性)的细胞色素P450单加氧酶的多肽和核酸序列。氧代异佛尔酮可用作维生素和类胡萝卜素合成中的结构单元。单氧化萜类(诸如异佛尔酮)是用于合成活性药物成分(API)、芳香剂和营养补充剂(例如维生素)的相关目标化合物。此类目标化合物的示例是氧代异佛尔酮(2,6,6-三甲基环己-2-烯-1,4-二酮；KIP)，所述氧代异佛尔酮可以通过异佛尔酮(IP)的氧化合成。KIP可以进一步异构化为三甲基氢醌(TMHQ)，三甲基氢醌是维生素E合成中的关键结构单元(更多细节参见例如Ullmann'sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第6版，完全修订版，第38卷，Wiley-VCH,2002)。此外，KIP还可以诸如经由左旋二酮(levodione)还原酶的催化作用而用作几种类胡萝卜素的重要前体，其中KIP被转换为手性中间体(4R,6R)-4-羟基-2,2,6-三甲基环己酮(放线醇(actinol))。r>不幸的是，如今已知的TMHQ的产生是时间、材料和成本密集的过程，所述过程需要高温和/或有机溶剂、有毒的重金属催化剂，并且产生不希望的副产物。尽管起始材料α-IP容易得到，但变成KIP的已知化学转换是非常低效的过程，其中首先将α-IP异构化为β-IP，之后均质液体氧化成KIP，该过程的平衡大大偏向α-IP：不超过2％的α-IP转换为β-IP。迄今为止，没有已知的替代方案(例如生物催化反应)经由对α-IP的区域选择性(regioselective)氧化而导致KIP的高产率。因此，强烈需要改进已知的维生素E合成，特别是改进作为来自维生素E前体的关键结构单元之一的KIP的产生，例如减少反应和纯化步骤和/或减少废物和过程能量需求，但特别是改进所述反应的区域选择性和总周转数(TTN)，尤其是在将α-IP氧化转换成KIP的过程中。令人惊讶的是，我们现在发现了一种新的到KIP的生物催化途径，即一种级联体系，在所述级联体系中从α-IP经由双烯丙基氧化(doubleallylicoxidation)产生KIP(图1A)。优选地，第一步骤是使用具有细胞色素P450酶活性的含血红素的氧化还原酶进行酶促转换，之后是第二步骤，所述第二步骤也可以是酶促转换，特别是经由NADP(H)或NAD(H)依赖性酶，诸如NADP(H)或NAD(H)依赖性氧化还原酶，或是本领域技术人员已知的化学氧化步骤。具体地，本专利技术提供了两步氧化方法，其中在步骤1中经由细胞色素P450酶的生物催化作用将α-IP转换为4-羟基-α-异佛尔酮(HIP)，并且其中在步骤2中将所述HIP转换，即氧化成KIP，所述步骤2是化学反应或经由合适的酶的作用催化。优选地，两个步骤作为一锅多酶转化反应执行。通过这种方法，我们能够获得范围为至少60％，诸如70％、80％、90％、95％或更高的转换率，即最高100％的转换率。细胞色素P450酶(CYP或P450)是多样超家族的血红素氧化还原酶，其能够执行许多氧化反应，最显著的是将氧插入化学惰性C-H键中，其中使用氧作为良性氧化剂并释放水作为副产物。在该催化循环期间，通过由NAD(P)H供应并由氧化还原配偶体(partners)运送的两个电子来实现氧活化。直接芳环羟基化是合成上有吸引力的反应，已报道了所述反应的几种P450酶。此类P450酶的众所周知的示例是来自Bacillusmegaterium的细胞色素P450CYP102A1，通常被称为P450BM3。P450BM3是118kDa的水溶性酶。迄今为止，这些酶几乎不用于生物技术方法，因为它们难以在已建立的宿主系统中表达并且在分离状态下对失活相当敏感。本领域公认的术语“TTN”被定义为在24小时期间计算的产物浓度和酶浓度的比率，并且是酶活性的决定性特征。TTN可以通过HPLC测量，特别是经由校准曲线(形成的产物)和CO差异光谱(酶浓度)测量。该方法在本领域中是已知的。TTN值的改进是本申请的一个特定主题。在一个实施方式中，本专利技术提供了将α-IP转换为4-羟基-α-异佛尔酮(HIP)的生物学方法，所述转换由具有P450单加氧酶活性的酶催化。因此，在本文定义的步骤1合适的条件下，在所述酶的存在下孵育α-IP。优选地，所述生物催化转换是双重氧化级联的第一部分，其中在步骤1中，α-IP被生物催化氧化成(HIP)，(HIP)随后在步骤2(如下定义)中被氧化成KIP。如本文所用，术语“酶”、“P450单加氧酶”、“细胞色素P450单加氧酶”或“P450酶”在本文中结合本专利技术的描述而可互换地使用。用于步骤1的酶可包括任何P450单加氧酶，包括从微生物、酵母或哺乳动物中分离的酶。优选地，生物催化剂/酶选自Bacillus、Geobacillus、Pseudomonas、Erythrobacter、Burkholderia、Herpetosiphon、Ralstonia、Bradyrhizobium、Azorhizobium、Streptomyces、Rhodopseudomonas、Rhodococcus、Delftia、Saccharopolyspora、Comamonas、Burkholderia、Cupriavidus、Variovorax、Fusarium、Gibberella、Aspergillus或Amycolatopsis的P450单加氧酶，更优选选自Bacillusmegaterium、Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Bacillusweihenstephanensis、Bacilluscereus、Bacillusanthracis、Pseudomonasputida、Burkholderiasp.383、Erythrobacterlitoralis、Geobacillussp.Y412MC10、Herpetosiphonaurantiacus、Ralstoniaeutropha、Ralstoniapickettii、Ralstoniametallidurans、Bradyrhizobiumjaponicum、Azorhizobiumcaulinodans、Streptomycesavermitilis、Rhodopseudomonaspalustris、Rhodococcussp.、Rhodococcusruber、Rhodococcussp.NCIMB9784、Delftiaacidov本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于将α-异佛尔酮转换为氧代异佛尔酮(KIP)的一锅生物催化方法，所述方法包括以下酶促步骤：/n(a)经由选自与SEQ ID NO:1具有至少35％同一性的多肽或与SEQ ID NO:3具有至少62％同一性的多肽的P450单加氧酶的催化作用以至少80％的转换率将α-异佛尔酮转换为4-羟基-α-异佛尔酮(HIP)，所述P450单加氧酶在与根据SEQ ID NO:3的P450cam-RhFRedP450单加氧酶中的位置96、87、244、247和/或它们的组合对应的位置上包含一个或多个突变，并且其中在4.0至10.0的pH下1h至48h的孵育条件下，与相应的未修饰的P450单加氧酶相比，总周转数增加了至少2倍，任选地从反应混合物中分离HIP；以及/n(b)经由具有醇脱氢酶或羰基还原酶活性的酶的催化作用将HIP转换为KIP，所述酶优选为来自Candida magnoliae的醇脱氢酶或来自Sporobolomyces salmonicolor的羰基还原酶，所述合适的条件包括在4.0至10.0的pH下1h至48h的孵育，任选地从反应混合物中分离KIP。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170407 EP 17165528.51.一种用于将α-异佛尔酮转换为氧代异佛尔酮(KIP)的一锅生物催化方法，所述方法包括以下酶促步骤：
(a)经由选自与SEQIDNO:1具有至少35％同一性的多肽或与SEQIDNO:3具有至少62％同一性的多肽的P450单加氧酶的催化作用以至少80％的转换率将α-异佛尔酮转换为4-羟基-α-异佛尔酮(HIP)，所述P450单加氧酶在与根据SEQIDNO:3的P450cam-RhFRedP450单加氧酶中的位置96、87、244、247和/或它们的组合对应的位置上包含一个或多个突变，并且其中在4.0至10.0的pH下1h至48h的孵育条件下，与相应的未修饰的P450单加氧酶相比，总周转数增加了至少2倍，任选地从反应混合物中分离HIP；以及
(b)经由具有醇脱氢酶或羰基还原酶活性的酶的催化作用将HIP转换为KIP，所述酶优选为来自Candidamagnoliae的醇脱氢酶或来自Sporobolomycessalmonicolor的羰基还原酶，所述合适的条件包括在4.0至10.0的pH下1h至48h的孵育，任选地从反应混合物中分离KIP。


2.根据权利要求1所述的方法，其中用于将α-异佛尔酮转换为4-羟基-α-异佛尔酮(HIP)和/或将HIP转换为氧代异佛尔酮(KIP)的所述生物催化方法是在以下项存在下进行的：(a)关于将α-异佛尔酮转换为HIP，选自葡萄糖、异丙醇和亚磷酸酯的共底物；或者(b)关于将HIP转换为KIP，选自丙酮、氯丙酮、乙酰乙酸乙酯、乙酰丙酸乙酯、氯丙酮和乙酰乙酸乙酯的共底物。


3.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中基于HIP和/或KIP的总量，朝向经由所述生物催化方法生成的HIP和/或KIP的(R)-构型的对映体过量是至少50％。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法在约30℃至40℃的温度下进行。


5.一种用于在根据权利要求1至4中任一项所述的方法中使用的经修饰的P450单加氧酶，所述经修饰的P450单加氧酶在与根据SEQIDNO:3的P450cam-RhFRedP450单加氧酶中的位置96、87、244、247和/或它们的组合对应的位置上包含一个或多个突变，其中：
(a)在与位置244对应的位置上引入的氨基酸选自由以下项组成的组：丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、半胱氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：维尔纳·邦拉蒂，乔西·鲁本·戈梅斯卡斯蒂利亚，安德莉亚·马特维，法维奥·帕梅吉亚尼，马丁·斯库尔曼，米歇尔·塔万蒂，尼古拉斯·特纳，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL