检测稻属细胞器基因组的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测稻属细胞器基因组的方法，其步骤是：首先设计特异重复序列引物及参数；其次选取并制备模板DNA：选择稻属不同种材料，生长两周取幼苗液氮研磨提取总DNA；然后建立PCR扩增体系：标准PCR扩增反应体系为10μl，模版使用上一步中DNA；第四建立荧光定量体系：标准荧光定量PCR反应体系为10μl，模版使用第二步中DNA；第五是细胞器基因组重复序列构象检测与分析。本发明专利技术利用其特异性重复序列，建立了一套分子标记，可快速、准确地通过实验手段检测稻属细胞器基因组中重复序列构象的差异，进而区分不同来源的细胞质。此方法具有准确、高效、快速的特点，既可定性检测稻属细胞器基因组，也可以定量检测重复序列的构象差异。

A method for detecting organelle genome of Oryza

The invention discloses a method for detecting organelle genome of Oryza. The steps are: first, design specific repeat sequence primers and parameters; second, select and prepare template DNA; select different materials of Oryza, grow for two weeks, take seedling liquid nitrogen and grind to extract total DNA; then establish PCR amplification system: the standard PCR amplification reaction system is 10 \u03bc L, and the template uses the DNA in the previous step; fourth, build Set up fluorescence quantitative system: the standard fluorescence quantitative PCR reaction system is 10 \u03bc L, and the template uses the DNA in the second step; the fifth is the conformation detection and analysis of the repeat sequence of organelle genome. The invention uses its specific repeat sequence to establish a set of molecular markers, which can quickly and accurately detect the conformation difference of repeat sequence in the organelle genome of Oryza by experimental means, and then distinguish the cytoplasm from different sources. This method is accurate, efficient and fast. It can not only detect the genome of rice organelles qualitatively, but also detect the conformational differences of repetitive sequences quantitatively.

【技术实现步骤摘要】
检测稻属细胞器基因组的方法
本专利技术涉及稻属细胞器基因组检测
，具体是指一种检测稻属细胞器基因组的方法。
技术介绍
水稻中，线粒体与叶绿体是重要并且特殊的细胞器。它们参与水稻基本的生理代谢活动，并且拥有自己的基因组和遗传方式。无论在线粒体基因组还是叶绿体基因组均存在重复序列，它们的构象差异可以改变基因组的结构，甚至改变重复序列附近基因的表达。线粒体虽然被认为突变速率慢于细胞核，但由于线粒体基因间区域容易发生重组或者发生细胞内基因组的交流，因而变异也非常丰富。叶绿体基因组虽然不像线粒体基因组那么多变，但其中的重复序列也存在构象差异。基因组的进化不仅包括核苷酸的突变，也包括基因组结构的变化。核苷酸突变的检测可以通过对突变热点区域进行Sanger测序完成。由于线粒体与叶绿体基因组核苷酸的突变较低，这种方法不敏感。虽然线粒体也叶绿体基因组结构的变化比较大，但现有方法是通过对全基因组进行重测序，这种方式不仅耗时长，成本也很高。此外，全基因组测序结果的分析对于大多数人来说是比较困难的。为了便于鉴定稻属线粒体与叶绿体基因组结构的差异，我们根据稻属线粒体与叶绿体基因组重复序列区的分子构象特征设计分子标记，通过大量筛选，建立了一套多态性丰富、稳定可靠的重复序列特异引物，可以有效检测重复序列的构象差异。同时，可根据不同重复序列构象的含量差异区分不同的细胞质来源。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种检测稻属细胞器基因组的方法，即是一种利用重复序列构象既可定性也可定量检测稻属细胞器基因组差异的方法，以水稻线粒体与叶绿体基因组遗传变异为基础，通过对线粒体与叶绿体重复序列区的广泛筛选，建立了一套多态性丰富、检测灵敏的重复序列分子标记。快速、准确地通过实验手段检测稻属细胞器基因组中重复序列的构象差异，并进而区分来源不同的细胞质。方法操作简便、稳定可靠，可用于稻属细胞器基因组重复序列构象的检测，具有准确、高效、快速的特点，既可定性也可定量检测稻属细胞器基因组重复序列构象，并区分不同来源的细胞质。为了实现上述目的，本专利技术提供的检测稻属细胞器基因组重复序列构象的方法(检测细胞器基因组重复序列构象的一套引物)，其具体步骤如下：A、重复序列分子标记及其参数(MRS为线粒体重复序列引物，CRS为叶绿体重复序列引物)：B、模版DNA的选取与制备：选择稻属材料：O.rufipogon,O.sativa,O.australiensis,O.barthii,O.brachyantha,O.glaberrima,O.glumipatula,O.longistaminata,O.meridionalis,O.nivara,O.officinalis,O.punctata，O.ridleyi,O.rhizomatis,O.minuta,O.malampuzhaensis,O.latifolia,O.grandiglumis,O.eichingeri,O.alta和O.longiglumis，生长两周后，每个材料取整株幼苗在液氮中研磨成粉状提取总DNA，DNA提取参照冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)出版、NinaIrwin和KaarenA.Janssen编著的《分子克隆》一书。C、PCR扩增体系的建立：标准的PCR扩增反应体系为10μl，组成如下：50ng/μl总DNA1μl，2×PCRMix5μl，10pM的引物F0.4μl，10pM的引物R0.4μl，去离子无菌水3.7μl，反应混合物用矿物油或石腊油覆盖，PCR程序如下：D、荧光定量体系的构建：荧光定量反应体系为20μl，组成如下：50ng/μl总DNA1μl，10μl2×HieffTMqPCRSYBR@GreenMasterMix，10pM的引物F0.8μl，10pM的引物R0.8μl，去离子无菌水7.4μl。E、细胞器基因组重复序列构象检测与分析：(1)统计PCR检测材料的扩增带，分析重复序列不同构象的有无，从而定性检测重复序列构象在不同品种中的差异；(2)通过荧光定量获得不同重复序列构象的Ct值，从而定量检测不同品种中重复序列不同构象含量的差异；(3)根据细胞器基因组重复序列重组产生的不同构象及其含量差异，快速区分不同来源的细胞质类型。本专利技术的有益效果及优点如下：(1)该方法开创了线粒体与叶绿体基因组重复序列构象检测的新技术，快速、准确、可靠。(2)设备简单，只需要PCR仪、台式离心机、荧光定量仪等即可，普通的分子生物学实验室皆可完成。(3)可进行高通量的样品检测：一次PCR反应可以检测96个材料。(4)应用范围广，可广泛用于稻属中各个种属的不同基因型检测。附图说明图1为本专利技术重复序列发生重组产生新构象的示意图。图2为本专利技术三种线粒体基因组重复序列与三种叶绿体基因组重复序列构象在不同稻属品种中的差异。图3为本专利技术一种线粒体基因组重复序列(MRS1)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。图4为本专利技术一种线粒体基因组重复序列(MRS3)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。图5为本专利技术一种线粒体基因组重复序列(MRS5)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。图6为本专利技术一种叶绿体基因组重复序列(CRS1)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。图7为本专利技术一种叶绿体基因组重复序列(CRS3)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。图8为本专利技术一种叶绿体基因组重复序列(CRS5)构象在粳稻中两个不同品种中的差异。具体实施方式实施例1：利用稻属细胞器基因组重复序列特异性引物检测基因组型，具体步骤如下：A、稻属细胞器基因组重复序列特异性引物设计：稻属细胞器基因组重复序列特异性引物如下表，其参数包括扩增片段的长度、退火温度。B、模版DNA的选取与制备：选择稻属材料：O.rufipogon,O.sativa,O.australiensis,O.barthii,O.brachyantha,O.glaberrima,O.glumipatula,O.longistaminata,O.meridionalis,O.nivara,O.officinalis,O.punctata，O.ridleyi,O.rhizomatis,O.minuta,O.malampuzhaensis,O.latifolia,O.grandiglumis,O.eichingeri,O.alta和O.longiglumis，生长两周后，每个材料取整株幼苗在液氮中研磨成粉状提取总DNA，DNA提取参照冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)出版、NinaIrwin和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测稻属细胞器基因组的方法，其特征在于：包含如下步骤：/nA、制得稻属细胞器基因组特异重复序列PCR引物，如下所示：/n(1)MRS1ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；/n(2)MRS1ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；/n(3)MRS1cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；/n(4)MRS1cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；/n(5)MRS2ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；/n(6)MRS2ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；/n(7)MRS2cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示；/n(8)MRS2cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；/n(9)MRS3ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.9所示；/n(10)MRS3ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.10所示；/n(11)MRS3cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.11所示；/n(12)MRS3cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.12所示；/n(13)MRS4ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.13所示；/n(14)MRS4ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.14所示；/n(15)MRS4cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.15所示；/n(16)MRS4cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.16所示；/n(17)MRS5ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.17所示；/n(18)MRS5ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.18所示；/n(19)MRS5cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.19所示；/n(20)MRS5cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.20所示；/n(21)MRS6ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.21所示；/n(22)MRS6ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.22所示；/n(23)MRS6cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.23所示；/n(24)MRS6cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.24所示；/n(25)MRS7ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.25所示；/n(26)MRS7ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.26所示；/n(27)MRS7cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.27所示；/n(28)MRS7cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.28所示；/n(29)MRS8ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.29所示；/n(30)MRS8ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.30所示；/n(31)MRS8cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.31所示；/n(32)MRS8cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.32所示；/n(33)MRS9ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.33所示；/n(34)MRS9ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.34所示；/n(35)MRS9cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.35所示；/n(36)MRS9cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.36所示；/n(37)MRS10ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.37所示；/n(38)MRS10ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.38所示；/n(39)MRS10cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.39所示；/n(40)MRS10cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.40所示；/n(41)MRS11ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.41所示；/n(42)MRS11ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.42所示；/n(43)MRS11cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.43所示；/n(44)MRS11cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.44所示；/n(45)MRS12ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.45所示；/n(46)MRS12ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.46所示；/n(47)MRS12cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.47所示；/n(48)MRS12cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.48所示；/n(49)MRS13ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.49所示；/n(50)MRS13ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.50所示；/n(51)MRS13cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.51所示；/n(...

【技术特征摘要】
1.一种检测稻属细胞器基因组的方法，其特征在于：包含如下步骤：
A、制得稻属细胞器基因组特异重复序列PCR引物，如下所示：
(1)MRS1ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.1所示；
(2)MRS1ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.2所示；
(3)MRS1cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.3所示；
(4)MRS1cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.4所示；
(5)MRS2ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.5所示；
(6)MRS2ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.6所示；
(7)MRS2cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.7所示；
(8)MRS2cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.8所示；
(9)MRS3ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.9所示；
(10)MRS3ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.10所示；
(11)MRS3cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.11所示；
(12)MRS3cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.12所示；
(13)MRS4ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.13所示；
(14)MRS4ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.14所示；
(15)MRS4cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.15所示；
(16)MRS4cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.16所示；
(17)MRS5ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.17所示；
(18)MRS5ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.18所示；
(19)MRS5cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.19所示；
(20)MRS5cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.20所示；
(21)MRS6ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.21所示；
(22)MRS6ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.22所示；
(23)MRS6cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.23所示；
(24)MRS6cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.24所示；
(25)MRS7ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.25所示；
(26)MRS7ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.26所示；
(27)MRS7cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.27所示；
(28)MRS7cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.28所示；
(29)MRS8ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.29所示；
(30)MRS8ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.30所示；
(31)MRS8cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.31所示；
(32)MRS8cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.32所示；
(33)MRS9ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.33所示；
(34)MRS9ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.34所示；
(35)MRS9cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.35所示；
(36)MRS9cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.36所示；
(37)MRS10ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.37所示；
(38)MRS10ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.38所示；
(39)MRS10cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.39所示；
(40)MRS10cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.40所示；
(41)MRS11ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.41所示；
(42)MRS11ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.42所示；
(43)MRS11cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.43所示；
(44)MRS11cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.44所示；
(45)MRS12ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.45所示；
(46)MRS12ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.46所示；
(47)MRS12cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.47所示；
(48)MRS12cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.48所示；
(49)MRS13ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.49所示；
(50)MRS13ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.50所示；
(51)MRS13cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.51所示；
(52)MRS13cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.52所示；
(53)MRS14ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.53所示；
(54)MRS14ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.54所示；
(55)MRS14cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.55所示；
(56)MRS14cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.56所示；
(57)MRS15ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.57所示；
(58)MRS15ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.58所示；
(59)MRS15cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.59所示；
(60)MRS15cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.60所示；
(61)MRS16ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.61所示；
(62)MRS16ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.62所示；
(63)MRS16cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.63所示；
(64)MRS16cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.64所示；
(65)MRS17ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.65所示；
(66)MRS17ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.66所示；
(67)MRS17cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.67所示；
(68)MRS17cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.68所示；
(69)MRS18ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.69所示；
(70)MRS18ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.70所示；
(71)MRS18cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.71所示；
(72)MRS18cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.72所示；
(73)MRS19ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.73所示；
(74)MRS19ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.74所示；
(75)MRS19cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.75所示；
(76)MRS19cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.76所示；
(77)MRS20ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.77所示；
(78)MRS20ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.78所示；
(79)MRS20cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.79所示；
(80)MRS20cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.80所示；
(81)MRS21ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.81所示；
(82)MRS21ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.82所示；
(83)MRS21cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.83所示；
(84)MRS21cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.84所示；
(85)CRS1ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.85所示；
(86)CRS1ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.86所示；
(87)CRS1cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.87所示；
(88)CRS1cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.88所示；
(89)CRS2ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.89所示；
(90)CRS2ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.90所示；
(91)CRS2cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.91所示；
(92)CRS2cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.92所示；
(93)CRS3ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.93所示；
(94)CRS3ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.94所示；
(95)CRS3cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.95所示；
(96)CRS3cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.96所示；
(97)CRS4ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.97所示；
(98)CRS4ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.98所示；
(99)CRS4cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.99所示；
(100)CRS4cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.100所示；
(101)CRS5ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.101所示；
(102)CRS5ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.102所示；
(103)CRS5cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.103所示；
(104)CRS5cd-R正向引物，其序列如SEQIDNO.104所示；
(105)CRS6ab-F正向引物，其序列如SEQIDNO.105所示；
(106)CRS6ab-R正向引物，其序列如SEQIDNO.106所示；
(107)CRS6cd-F正向引物，其序列如SEQIDNO.107所示；
(108)CRS6cd-R正向引物，其序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：李绍清，杨伟龙，邹佳宁，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42