用于提取和扩增核酸的试剂制造技术

本发明专利技术解决的问题在于提供用于提取/扩增核酸提取对象的核酸的试剂，所述试剂的特征在于简单、快速且高效地从核酸提取对象中提取核酸并且最小化核酸扩增反应的抑制，以及解决的问题在于提供使用所述试剂提取和扩增核酸的方法。通过使用用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的试剂盒来解决所述问题，所述试剂盒包括(i)至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂，(ii)具有碳数为1‑4的羟烷基的γ‑环糊精，和(iii)核酸扩增试剂。

Reagents for extraction and amplification of nucleic acids

The problem solved by the invention is to provide a reagent for extracting / amplifying the nucleic acid of the nucleic acid extracting object, which is characterized by simple, rapid and efficient extraction of nucleic acid from the nucleic acid extracting object and minimizing the inhibition of the nucleic acid amplification reaction, and the problem solved is to provide a method for extracting and amplifying the nucleic acid using the reagent. The problem is solved by using a kit for extracting and amplifying the nucleic acid of the nucleic acid extraction object from a sample containing the nucleic acid extraction object, the kit comprising (I) a nucleic acid extraction reagent having at least a surfactant having a steroid skeleton, (II) a \u03b3 - cyclodextrin having a 1-4-carbon hydroxyalkyl group, and (III) a nucleic acid amplification reagent.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提取和扩增核酸的试剂
本专利技术涉及用于简单、快速且高效地提取和扩增核酸的试剂，以及使用该试剂提取和扩增核酸的方法。
技术介绍
在传染病的临床检查领域，简单、快速且高灵敏度地检测病原体是非常重要的，并且快速检测试剂盒已广泛普及。使用核酸扩增技术的检测方法已知是用于高灵敏度检测病原体的方法。当通过使用核酸扩增技术的这类检测方法检测病原体时，通常预先进行从含有病原体的样品中提取核酸的操作。在这样的情况下采用的方法已知涉及使用表面活性剂从病原体提取核酸、使用环糊精中和表面活性剂对核酸扩增反应的抑制作用、以及使核酸进行扩增核酸的步骤。在专利文献1中，将通过用官能团修饰来制备的α、β、γ-环糊精列为用于核酸扩增反应的试剂的组分，并且例示碳数为1-4的羟烷基等作为官能团。专利文献1进一步描述了在文中添加的2-羟丙基-β-环糊精和例如脱氧胆酸钠等表面活性剂共存的情况下进行PCR，然后通过添加环糊精改善DNA聚合酶对抑制作用的抗性。然而，专利文献1并没有具体记载作为环糊精的具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2014-198029号公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的是提供用于提取和扩增核酸的试剂，因此从例如微生物等核酸提取对象中简单、快速且高效地提取核酸，并且最小化核酸扩增反应的抑制。用于解决问题的方案作为实现上述目的的深入研究的结果，本专利技术人完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下实施方案。<1>一种用于从含有核酸提取对象的样品提取和扩增核酸提取对象的核酸的试剂盒，其包括以下(i)、(ii)和(iii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡(extracellularvesicle)：(i)至少含有具有甾体类(steroid)骨架的表面活性剂的核酸提取试剂；(ii)具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精；和(iii)核酸扩增试剂。<2>根据<1>所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精。<3>根据<1>或<2>所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精包含在核酸扩增试剂中。<4>根据<1>至<3>任一项所述的试剂盒，其中具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上。<5>根据<1>至<4>任一项所述的试剂盒，其中核酸提取对象为微生物。<6>一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的方法，其包括以下步骤(i)、(ii)和(iii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；(ii)将(i)中得到的核酸提取物与具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精接触的步骤；和(iii)核酸扩增步骤，其将(ii)中得到的溶液与核酸扩增试剂接触。<7>一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增核酸提取对象的核酸的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)，其中核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：(i)核酸提取步骤，其将含有核酸提取对象的样品与至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂的核酸提取试剂接触，从而得到核酸提取物；和(ii)核酸扩增步骤，其将(i)中得到的核酸提取物与含有具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的核酸扩增试剂接触。<8>根据<6>或<7>所述的方法，其中核酸提取对象为微生物。以下将更具体地描述本专利技术。在本专利技术中，术语“具有甾体类骨架的表面活性剂”是指具有甾环(cyclopentanoperhydrophenanthrene)结构以及表面活性作用的化合物。天然存在的具有甾体类骨架的表面活性剂的实例为胆汁酸。胆汁酸是具有胆烷酸骨架的甾体类衍生物，并且通常与甘氨酸或牛磺酸结合以形成缀合的胆汁酸。天然存在的胆汁酸和胆汁酸衍生物的实例可包括胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、石胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛黄胆酸、甘氨胆酸及其盐。这样的盐的实例可包括但不特别限于钠盐。此外，本专利技术中的表面活性剂的实例不仅可包括天然存在的甾体类衍生物和胆汁酸衍生物，还可包括人工合成的具有甾体类骨架或胆烷酸骨架的表面活性剂。本专利技术中的表面活性剂的特别合适的实例包括胆酸、牛黄胆酸、甘氨胆酸、牛磺熊去氧胆酸及其盐，并且更优选胆酸及其盐，特别是胆酸钠。应注意的是，具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度没有特别限制。当核酸提取自例如微生物等核酸提取对象时，浓度优选0.4(w/w)％以上，更优选1.0(w/w)％以上，并且进一步优选1.5(w/w)％以上。其上限没有特别限制，并且浓度优选10.0(w/w)％以下，更优选5.0(w/w)％以下，并且进一步优选3.0(w/w)％以下。本专利技术的核酸提取对象的实例包括微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡，但不限于生物体并且广泛地包括在膜中包封核酸的那些。其特别优选的实例包括使用具有甾体类骨架的表面活性剂提取的那些。此外，在提取过程中，可以使用细胞壁溶解酶、蛋白酶、或磷脂降解酶等促进提取。再者，还优选通过使用氧化锆粉末、加热、pH变化、或渗透压等物理作用来促进提取。在此，核酸可以是DNA或RNA。除衣壳和细胞壁以外，膜的实例包括被膜和例如细胞膜等的脂质双层膜。此外，微生物的实例包括病毒、支原体、细菌、和真菌。提取对象的实例优选包括病毒和支原体。病毒具有称为衣壳的包封核酸的蛋白壳的结构。由于所述结构，用常规提取方法难以提取核酸。通过应用本专利技术的提取方法，可以简单快速地提取核酸。待提取的病毒的种类是没有限制的。优选的提取对象病毒的实例包括具有被膜的病毒和具有单链RNA的病毒。术语“具有被膜的病毒”是指其中病毒衣壳被主要由脂质构成的被膜覆盖的病毒，并且其实例包括单纯疱疹病毒、流感病毒、RS病毒、和AIDS病毒(HIV)。术语“具有单链RNA的病毒”是指属于基于巴尔的摩分类法的第4组(单链RNA+链)、第5组(单链RNA–链)、或第6组(单链RNA逆转录)的病毒。其实例包括冠状病毒、RS病毒、人偏肺病毒、流感病毒、和AIDS病毒(HIV)。具有单链RNA的病毒是优选的，这是由于这些病毒适用于使用RNA作为起始材料的例如TRC法等核酸扩增技术。在这些实例中，特别优选流感病毒作为用于本专利技术的提取试剂的提取对象病毒。本专利技术中的术语“支原体”是指属于支原体属(Mycoplasma)的那些并且其实例可包括猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia)、莱氏无胆甾原体(Acheloplasmalaidlawii)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、口腔支原体(Mycoplasmaorale)、柑橘僵化螺原体(Spiroplasmacitri)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae)、鸡毒支原体(Mycoplasmag本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增所述核酸提取对象的核酸的试剂盒，其包括以下(i)、(ii)和(iii)，其中所述核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：(i)核酸提取试剂，其至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂；(ii)具有碳数为1‑4的羟烷基的γ‑环糊精；和(iii)核酸扩增试剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.13 JP 2017-047428;2017.05.16 JP 2017-097201.一种用于从含有核酸提取对象的样品中提取和扩增所述核酸提取对象的核酸的试剂盒，其包括以下(i)、(ii)和(iii)，其中所述核酸提取对象选自微生物、动物细胞、植物细胞、和细胞外小泡：(i)核酸提取试剂，其至少含有具有甾体类骨架的表面活性剂；(ii)具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精；和(iii)核酸扩增试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精为2-羟丙基-γ-环糊精。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精包含在所述核酸扩增试剂中。4.根据权利要求1至3任一项所述的试剂盒，其中所述具有碳数为1-4的羟烷基的γ-环糊精的浓度是所述具有甾体类骨架的表面活性剂的浓度的4倍以上。5.根据权利要求1至4任一项所述的试剂盒，其中所述核酸提取对象是微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤宽，
申请(专利权)人：东曹株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP