一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法。阳极氧化铝纳米通道两端处喷涂金层，金层一部分作为电极，金层另一部分作为导电部分，导电部分包裹绝缘物，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，制成集成式纳米通道电极；金层作为电极反映电化学性能，并且纳米通道本身作为纳米级过滤器，构建集分离和检测于一身的系统；磁性纳米粒子与抗体的复合物捕获样品中的细菌后，保留在集成式纳米通道电极的表面上。本发明专利技术提供了一种快速简便的基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，为纳米通道的研究带来了新的思路，并为分离和检测领域提供了新的途径，进一步保障食品和环境安全。

【技术实现步骤摘要】
一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法
本专利技术属于基于纳米通道的电化学分析检测
，具体涉及一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法。
技术介绍
食源性致病菌是引发食源性疾病的主要原因，在食品生产、加工、储存、运输和销售的每个过程中都有可能造成污染，导致食源性疾病的发生，对公共卫生和人类健康造成重大威胁。其中，沙门氏菌作为一种常见的食源性致病菌，严重影响食品安全和生命健康。因此，有必要建立一种快速灵敏的沙门氏菌检测方法。固态纳米通道是以生物纳米通道为基础发展起来的，由于其结构稳定、形状可控和便于修饰等优点，目前已经在分子过滤、能量转换、生物传感等领域广泛应用。电化学方法操作简便，灵敏度高，可以反映电极表面的性质，综合电化学和纳米通道的优点，有助于实现多功能、高灵敏的分析检测。磁性纳米粒子(MNPs)凭借其强磁性、高表面积、丰富的表面性质，在体外和体内的诸多领域得到了广泛应用，包括分离，纯化，生物传感，定向载药释药和疾病诊断等。通常情况下，需要对MNPs进行表面修饰，如适配体、抗体和多肽，从而分离和浓缩目标物，减少不必要的干扰，提高灵敏度。为了输出信号，MNPs还需要额外的信号标记物，使分析检测变得复杂，增加了成本和操作时间。因此，在基于MNPs的分析检测中，首要任务是排除信号标记物的干扰和限制，从而实现快速、简便、灵敏的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述问题，提供一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，它无需外加信号标记物，整合了纳米通道的高效分离功能和电化学技术的高灵敏度，对沙门氏菌实现快速简便的分离和检测。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：(1)集成式纳米通道电极的制备和预处理(1.1)制备集成式纳米通道电极阳极氧化铝(AAO)纳米通道两端处喷涂金层，金层的一部分(以直径φ＝1.5mm范围)暴露作为电极，金层的另一部分作为导电部分，导电部分用绝缘物密封包裹并绝缘，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，使得两端金层上施加电压，从而形成集成式纳米通道电极(INCE)；所述的阳极氧化铝(AAO)纳米通道的孔径为500nm。(1.2)集成式纳米通道电极的清洗和预处理在集成式纳米通道电极(INCE)两端的金层处分别滴加10μL0.5MH2SO4溶液，静置清洗15分钟，然后用H2O彻底冲洗；然后在冲洗干净的集成式纳米通道电极(INCE)的两端处分别再滴加10μL1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液，常温下封闭1小时，然后用H2O彻底冲洗；(2)磁性纳米粒子-抗体复合物制备将羧基磁性纳米粒子用含吐温-20的2-(N-吗啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液(MEST)(25mM，pH＝6.0)清洗并离心3次，重悬在10mMN-羟基琥珀酰亚胺磺酸(NHSS)和15mM1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)的溶液中，含吐温-20的硼酸盐缓冲液(BST)(10mM，pH＝7.4)清洗并离心3次，重悬在17μg/mL沙门氏菌抗体的含吐温-20的硼酸盐缓冲液(BST)溶液中反应2.5小时，加入10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1小时，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)(10mM，pH＝7.4)清洗三次并重悬，制备获得磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)于4℃保存备用；(3)细菌培养和平板计数(3.1)培养沙门氏菌取0.5mL沙门氏菌储备液于9mL脑心浸液培养基(BHI)中，放于37℃的摇床内培养过夜作为初始菌液，将初始菌液在沸水中灭活10分钟以彻底灭菌，PBS清洗三次并重新分散于PBS中，用无菌PBS溶液10倍稀释得到一系列稀释液，获得菌液，以供进一步使用；(3.2)沙门氏菌平板计数取103CFU/mL含量的步骤(3.1)获得的菌液100μL铺盘于XLT4琼脂培养基中，37℃培养24小时后，对形成的菌落进行计数；(4)电化学方法检测细菌(4.1)将100μL的磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)与1mL的步骤(3.1)获得的菌液混合，在常温下孵育45分钟；进行磁分离处理，然后用200μL的含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗三次，最终重新分散于50μL的含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)中，得到细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物(MNPs-Ab-St)；(4.2)将集成式纳米通道电极(INCE)夹在3D装置中，取10μL细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物(MNPs-Ab-St)注入3D装置中的集成式纳米通道电极(INCE)一侧之后，施加压力使溶液流经集成式纳米通道电极(INCE)至集成式纳米通道电极(INCE)的另一侧；(4.3)用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)代替复合物MNPs-Ab-St溶液以步骤(4.2)同样的操作注入两次后，将10μL的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6溶液分别注入3D装置中集成式纳米通道电极(INCE)的两侧表面，并进行电化学阻抗(EIS)测试，检测集成式纳米通道电极(INCE)两端电极的信号，经信号处理获得沙门氏菌的检测结果。将细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物(MNPs-Ab-St)对应的的EIS信号处理获得电荷转移电阻Rct1，对照组磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)对应的EIS信号处理获得电荷转移电阻Rct0，对照组是仅磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)处理通过3D装置中的INCE的实验组，将Rct1与对照Rct0的差值作为定量响应信号△Rct，定量响应信号△Rct通过标定关系曲线参照获得沙门氏菌的浓度值。标定关系曲线是由一系列已知浓度的沙门氏菌进行实验获得的对应的定量响应信号△Rct进行拟合获得。如图2所示，所述步骤(4)的3D装置包括夹片、通孔和O形橡胶圈；两片夹片相对布置，并且在两片夹片相对表面的中心开设有环形凹槽，环形凹槽中均安装有O形橡胶圈，两个O形橡胶圈之间装夹集成式纳米通道电极，集成式纳米通道电极经导线连接出，集成式纳米通道电极和两片夹片之间不接触，具有间隙，两片夹片在环形凹槽中央处均开设有通孔，溶液经一片夹片的通孔流入穿过一侧的O形橡胶圈进入集成式纳米通道电极，从集成式纳米通道电极流出后穿过另一侧的O形橡胶圈后，经另一片夹片的通孔流出。将集成式纳米通道电极夹在3D装置的两个夹片中间，进行后续的过滤和检测。所述的夹片采用固态树脂。所述的绝缘物为胶带。本专利技术通过在阳极氧化铝纳米通道的两侧引入金层，制备的集成式纳米通道电极(INCE)的两个金层可以作为电极反映电化学性能，并且纳米通道本身作为纳米级过滤器，构建集分离和检测于一身的系统。当磁性纳米粒子(MNPs)与抗体的复合物(MNPs-Ab)捕获样品中的细菌后，由于其尺寸大于纳米通道的孔径，因此被保留在INCE的表面上。本专利技术的积极效果是：本专利技术与现有方法相比，实现了沙门氏菌的集成式纳米通道电极分离检测，操作简便，无需外加信号标记物，整合了纳米通道的高效分离功能和电化学技术的高灵敏度，能快速、准确分离和检测沙门氏菌，在基于纳米通道的电化学分析检测
具有创新性和应用前景。本专利技术方法，为纳米通道的研究带来了新的思路，并为分离和检测领域提供了新的途径，进一步保障食品和环境安全。附图说明图1显示为本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)集成式纳米通道电极的制备和预处理(1.1)制备集成式纳米通道电极阳极氧化铝(AAO)纳米通道两端处喷涂金层，金层的一部分暴露作为电极，金层的另一部分作为导电部分，导电部分用绝缘物密封包裹并绝缘，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，从而形成集成式纳米通道电极(INCE)；(1.2)集成式纳米通道电极的清洗和预处理在集成式纳米通道电极(INCE)两端的金层处分别滴加10μL 0.5M H2SO4溶液，静置清洗15分钟，然后用H2O彻底冲洗；然后在冲洗干净的集成式纳米通道电极(INCE)的两端处分别

【技术特征摘要】
1.一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)集成式纳米通道电极的制备和预处理(1.1)制备集成式纳米通道电极阳极氧化铝(AAO)纳米通道两端处喷涂金层，金层的一部分暴露作为电极，金层的另一部分作为导电部分，导电部分用绝缘物密封包裹并绝缘，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，从而形成集成式纳米通道电极(INCE)；(1.2)集成式纳米通道电极的清洗和预处理在集成式纳米通道电极(INCE)两端的金层处分别滴加10μL0.5MH2SO4溶液，静置清洗15分钟，然后用H2O彻底冲洗；然后在冲洗干净的集成式纳米通道电极(INCE)的两端处分别再滴加10μL1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液，常温下封闭1小时，然后用H2O彻底冲洗；(2)磁性纳米粒子-抗体复合物制备将羧基磁性纳米粒子用含吐温-20的2-(N-吗啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液(MEST)清洗并离心3次，重悬在10mMN-羟基琥珀酰亚胺磺酸(NHSS)和15mM1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)的溶液中，含吐温-20的硼酸盐缓冲液(BST)清洗并离心3次，重悬在17μg/mL沙门氏菌抗体的含吐温-20的硼酸盐缓冲液(BST)溶液中反应2.5小时，加入10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1小时，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗三次并重悬，制备获得磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)于4℃保存备用；(3)细菌培养和平板计数(3.1)培养沙门氏菌取0.5mL沙门氏菌储备液于9mL脑心浸液培养基(BHI)中，放于37℃的摇床内培养过夜作为初始菌液，将初始菌液在沸水中灭活10分钟以彻底灭菌，PBS清洗三次并重新分散于PBS中，用无菌PBS溶液10倍稀释得到一系列稀释液，获得菌液，以供进一步使用；(3.2)沙门氏菌平板计数取103CFU/mL含量的步骤(3.1)获得的菌液100μL铺盘于XLT4琼脂培养基中，37℃培养24小时后，对形成的菌落进行计数；(4)电化学方法检测细菌(4.1)将100μL的磁性纳米粒子-抗体复合物(MNPs-Ab)与1mL的步骤(3.1)获得的菌液混合，在常温下孵育45分钟；进行磁分离处理，然后用200μL的含吐温-20的磷酸盐缓冲液(...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅迎春，朱文越，李延斌，应义斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33