一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法。本发明专利技术涉及使用单模微波蛋白水解仪将多糖降解为单糖，再应用阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析多糖的单糖组成。本发明专利技术的技术方案具有水解快速，10分钟可完成样品降解；一次可降解10个样品；与传统方法使用相同的酸；酸用量少，只需10μL 3 mol/L HCl；操作步骤简单易学、无需衍生和直接上样等优点。

Determination of monosaccharide in polysaccharides by microwave acid hydrolysis and anion exchange chromatography pulse amperometric method

【技术实现步骤摘要】
一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法。
技术介绍
大多数对多糖的单糖组成分析方法分为两步：酸水解和单糖衍生后检测。这两个步骤都需要克服降解多糖的一些特殊的化学和非光学特性。例如，为了避免副反应，酸水解步骤需要在密封的安瓿瓶里1mL酸水解10μL多糖样品3-6h。用酸量大，污染环境，耗时长且操作繁琐。多糖或聚糖的复杂性不仅仅由于它们没有生物合成模板，也由于不同的单糖组成，包括中性，酸性和碱性单糖。另外，单糖之间特殊的连接方式会形成线性，分支，均一或者杂多糖或者聚糖。因此，多糖不是纯的化合物，由于分子量的多元化，连接位置，多糖组成，生物活性，这些对于多糖药物、保健品和其他的生物产品(肝素，硫酸软骨素，岩藻多糖，藻酸双酯钠，壳聚糖，α-和β-环糊精)来说，都是重要的质量控制问题。对于药用多糖来说，质控中多糖的单糖组成分析是十分必要的。然而，在没有酸的水解条件下，不同的单糖释放速率不同，甚至在特殊的糖苷键连接的多糖中，同一种单糖的释放速率也不同。然而，在酸性环境中，高温度时(～100℃)，相对于中性和碱性单糖来说，释放的酸性单糖不稳定。为了克服这个问题，在Pico-Tag工作站中用6mol/LHCl水解富含GlcN/GalN的多糖(如肝素，硫酸软骨素)，水解3h。在这个方法中，反应管被放在Pico-Tag工作站的真空/气体交换端口。反应管抽真空直到里面的盐酸开始冒泡，然后充满氮气。几个循环之后，关闭氮气阀。之后，反应管被放在Pico-Tag工作站的烘箱中，100℃反应3h。随后，将酸蒸出，终止酸水解。但是，在过去的20年里，大多数蛋白质的cDNA测序完成后，用于蛋白质氨基酸组成分析的Pico-Tag工作站在市场上是没有的。由于没有相应的设备阻隔水解反应管中的氧气，大多数的实验室选择另一种替代方法来水解多糖，就是在密封的安瓿瓶里用1mL2mol/Ltrifluoroaceticacid(TFA)在100℃条件下，水解10μL多糖样品需要4h来释放中性单糖。水解后，需要大约6h移除水解样品中的TFA，之后，用PMP衍生单糖进行HPLC分析。这种传统的方法，水解需要4h，移除酸需要大约6h，70℃衍生需要1h，萃取移除PMP需要40min。自从有报道将家用微波炉用于快速的有机合成，微波炉也变成了一种高效的非传统的方法用于糖蛋白的脱糖基化工具。然而，家用微波炉的反应条件很难控制。这种新颖的类似于Pico-Tag工作站的微波系统-CEMDiscover单模微波蛋白水解仪，还没有被报道用于多糖的单糖组成分析。
技术实现思路
由于传统烘箱水解方法用酸量大、污染环境、耗时长且操作繁琐的问题，本专利技术的目的是提供了一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)称取待测多糖，用HCl溶解待测多糖得到溶解液，取所述溶解液使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；(2)微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；(3)离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；(4)将得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；(5)离心后的上清液进行阴离子交换色谱-脉冲安培法分析，得到色谱图；(6)制备多种单糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测多糖中的单糖组分。进一步的：所述步骤(1)中待测多糖用1mol/L-5mol/LHCl溶解多糖得到溶解液。进一步的：所述步骤(1)中微波酸水解的条件是：功率80w-100w，温度80℃-100℃，水解时间5min-15min。进一步的：所述步骤(1)中微波酸水解的条件是：功率100w，温度100℃，水解时间10min。进一步的：所述步骤(5)中的色谱条件为：分析柱：ThermoScientificDionexCarboPACTMPA10，4.0mm×250mm，保护柱：ThermoScientificDionexCarboPACTMPA10，4.0mm×50mm，淋洗液：0-15min使用18mMNaOH；15.1-30min使用18mMNaOH和150mMCH3COONa的混合液，流速：1.0mL/min，进样体积：10μL，柱温：30℃。进一步的：所述步骤(6)中的单糖包括岩藻糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。进一步的：所述步骤(6)中单糖标准曲线的浓度范围为0.00005mg/mL-0.05mg/mL。与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术提供了一种高效快速的水解结合分析单糖组成的分析方法。利用本专利技术的技术方案，微波酸水解仅需要10μL样品和10μLHCl，水解时间仅需10分钟，一次可水解10个样品，之后，利用阴离子交换色谱-脉冲安培法进行分析，具有不需要衍生、高效且快速的优点。这种方法被证实具有线性好(R2,0.9908–0.9997)、精度高(相对标准偏差<4.33％)、较好的灵敏度(检测限:4.35×10-6-5.88×10-5mg/mL，即0.004–0.06ppm)和运行时间短(18/30min)的优点。本专利技术的技术方案是一种可以替代的分析酸性、中性和碱性多糖(如：壳聚糖，α-环糊精，β-环糊精，藻酸双酯钠，岩藻多糖，肝素和硫酸软骨素)中单糖组成的方法。因此，本专利技术的技术方案具有降解快速(10分钟快速完成样品处理)，批通量(一次降解多达10个20微升的样品)，兼容性(微波酸水解使用传统方法相同的酸)，酸用量少(仅需10微升)，操作步骤简单易学(无需衍生，直接上样)等优点。所得结果显示此降解分析方法可以快速降解，分析多糖的单糖组成，节省时间，并可以计算得到其单糖组成含量。附图说明图1是功率对7种不同多糖微波酸水解的影响；图2是温度对7种不同多糖微波酸水解的影响；图3是水解时间对7种不同多糖微波酸水解的影响；图4是传统烘箱水解和微波酸水解对降解7种不同多糖的比较。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。实施例1本专利技术提供了一种利用微波酸降解结合阴离子交换色谱-脉冲安培法进行分析多糖中单糖组成的检测方法，本实施例以降解七种多糖为例，所述7种多糖为壳聚糖(Chitosan)，α-环糊精(α-CD)，β-环糊精(β-CD)，藻酸双酯钠(PSS)，岩藻多糖(Fucoidan)，肝素(HP)和硫酸软骨素A(CSA)。所述7种多糖中壳聚糖属于碱性多糖；α-环糊精和β-环糊精属于中性多糖；藻酸双酯钠属于酸性多糖；岩藻多糖，肝素和硫酸软骨素A属于复杂多糖。一、本专利技术所述的利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法具体包括以下步骤：(1)制备单糖的标准曲线精密称取岩藻糖(Fuc)，半乳糖胺(GalN)，葡萄糖胺(GlcN)，半乳糖(Gal)，葡萄糖(Glc)，甘露糖(Man)和葡萄糖醛酸(Glc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：(1) 称取待测多糖，用HCl溶解待测多糖得到溶解液，取所述溶解液使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；(2) 微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；(3) 离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；(4) 将得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；(5) 离心后的上清液进行阴离子交换色谱‑脉冲安培法分析，得到色谱图；(6) 制备多种单糖的标准曲线；(7) 将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测多糖中的单糖组分。

【技术特征摘要】
1.一种利用微波酸水解和阴离子交换色谱-脉冲安培法分析多糖中单糖组成的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：(1)称取待测多糖，用HCl溶解待测多糖得到溶解液，取所述溶解液使用单模微波蛋白水解仪进行微波酸水解；(2)微波酸水解后的水解液离心浓缩除酸；(3)离心后的样品中添加甲醇，离心浓缩除残留HCl；(4)将得到的干燥样品用水溶解，离心取上清；(5)离心后的上清液进行阴离子交换色谱-脉冲安培法分析，得到色谱图；(6)制备多种单糖的标准曲线；(7)将步骤(5)得到的色谱图与步骤(6)中单糖的标准曲线比对并分析计算，确定待测多糖中的单糖组分。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中待测多糖用1mol/L-5mol/LHCl溶解多糖得到溶解液。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中微波酸水解的条件是：功率80w-100w，温度80℃-100℃，水解时间5min-15min。4.根据权利要求3所述的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽娟，何燕利，
申请(专利权)人：青岛大学附属医院，
类型：发明
国别省市：山东,37