一种表达VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株制造技术

本发明专利技术构建了一株表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株并对其应用进行了探究。本发明专利技术利用同源重组技术，将包含传染性法氏囊病毒VP2基因和CMV启动子序列的基因片段CMV‑VP2及含flp识别位点的Kana基因插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗SC9‑1株的UL45/UL46基因之间，构建获得在UL45/UL46基因间插入CMV‑VP2表达框和Kana表达框的重组质粒，而后通过阿拉伯糖将Kana基因诱导掉，得到只含有CMV‑VP2表达框的重组质粒，由其拯救获得表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。研究表明，本发明专利技术获得的疫苗株具有与亲本毒SC9‑1疫苗株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，并且能够同时抵抗MDV超强毒株以及IBDV超强毒株的攻击。由此可见，本发明专利技术获得的表达IBDV‑VP2基因的重组MDV疫苗株可用于预防鸡传染性法氏囊病和马立克氏病。

A recombinant Marek's disease virus strain expressing VP2 gene

【技术实现步骤摘要】
一种表达VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株
本专利技术属于分子生物学和基因工程疫苗
，具体涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒株，该重组病毒免疫家禽可用于传染性法氏囊病及马立克氏病的预防。技术背景马立克氏病(Marek’sdisease，MD)和鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease,IBD)是常见的两种影响家禽生产性能的免疫抑制病。其中，IBD是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的禽类急性、高度接触性免疫抑制性传染病，该病主要感染3周龄～12周龄青年鸡，可通过导致鸡法氏囊损伤、引起免疫抑制和雏鸡死亡等对家禽养殖造成巨大的经济损失。因此，几十年来，该病一直威胁着养禽业的发展。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽医局(OIE)认为IBD已经成为影响社会经济的重要疾病。研究表明IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段和B节段。A节段编码的VP2蛋白构成病毒的外衣壳，是IBDV的主要结构蛋白。VP2可以诱导机体产生中和抗体，是IBDV主要的宿主保护性抗原。IBD的免疫预防已成为目前防控该病的主要措施，而商品化的传染性法氏囊病活疫苗分为弱毒、中等毒力和强毒三类。弱毒活疫苗对有母源抗体鸡群的免疫保护效果不理想。与弱毒疫苗相比，中等毒力和强毒疫苗的免疫保护力虽然高很多，但由于其具有一定的致病性，对法氏囊有一定的损伤。同时，由于受母源抗体干扰及IBDV的特点，导致传统疫苗在实际应用中形成不可避免的免疫空白期。因此，针对传染性法氏囊病新型疫苗的研究成为目前的热点之一。IBDV的VP2蛋白是主要的免疫保护性抗原，针对VP2蛋白的中和抗体可抵御IBDV强毒株的攻击，因此构建表达IBDV-VP2基因的重组活载体疫苗具有潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒株，该重组病毒免疫家禽可用于传染性法氏囊病及马立克氏病的预防。该病毒株可用于家禽中诱导针对IBDV的保护性免疫应答，并可预防马立克氏病，从而弥补现有疫苗市场的不足。本专利技术所提供的表达IBDV-VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，是将VP2基因表达框插入到Ⅰ型马立克氏病毒的UL45区和UL46区之间。更具体的，所述的插入位点位于Ⅰ型马立克氏病毒基因组UL45区和UL46区之间的103909nt-103910nt之间；所述的VP2基因，其编码序列的核苷酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术提供的重组马立克氏病毒，其插入的VP2基因表达框中IBDV-VP2基因的调控元件由CMV启动子负责VP2基因的起始转录，BGHployA终止子为VP2基因mRNA转录提供终止信号，同时为mRNA3’端添加polyA尾巴；所述的VP2基因表达框，其一种具体的核苷酸序列为SEQIDNO:2；本专利技术所提供的表达IBDV-VP2基因的重组马立克氏病毒，其一种具体的病毒株为马立克氏病毒YBSC9-1vVP2株，已于2019年04月28日保藏在位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201923。本专利技术的YBSC9-1vVP2株可用于表达IBDV-VP2蛋白。本专利技术的YBSC9-1vVP2株的另一方面的用途是用于制备疫苗。本专利技术在Ⅰ型MDV株UL45区及UL46区之间插入IBDV-VP2基因构建的重组疫苗株不仅克服了现有IBD弱毒疫苗的不足，而且安全性高，可以同时有效预防IBD和MD两种重要的禽类传染病，能够为动保行业产生社会经济效益，因此，希望该疫苗能够规模化生产应用于家禽市场。附图说明图1：重组病毒YBSC9-1vVP2基因组中外源基因VP2插入位点示意图；图2：重组病毒YBSC9-1vVP2基因组构建模式图；图3：VP2表达框及Kana表达框PCR电泳图；其中，VP2：VP2表达框；Kana：Kana表达框；VP2+Kana：VP2和Kana串联表达框。图4：VP2表达框及Kana表达框转移模式图；图5：中间质粒PUC19-VP2-KanaVP2基因表达的荧光图；其中，PUC19-VP2-Ka:PUC19-VP2-Ka质粒转染的CEF细胞荧光图；PUC19:PUC19载体对照。图6：拯救的重组病毒蚀斑图；其中，UL45/46：重组病毒YBSC9-1vVP2UL45/46蚀斑图；UL41：重组病毒YBSC9-1vVP2UL41蚀斑图；US2：重组病毒YBSC9-1vVP2US2蚀斑图。图7：重组病毒基因组DNAPCR鉴定图；其中，SC9-1：SC9-1基因组PCR鉴定条带；UL45/46P10(P20)：YBSC9-1vVP2UL45/46第10(20)代基因组PCR鉴定条带；UL41P10(P20)：YBSC9-1vVP2UL41第10(20)代基因组PCR鉴定条带；US2P10(P20)：YBSC9-1vVP2US2第10(20)代基因组PCR鉴定条带。图8：IFA鉴定重组病毒外源基因VP2表达的荧光图；其中，UL45/46：YBSC9-1vVP2UL45/46荧光图；UL41：YBSC9-1vVP2UL41荧光图；US2：YBSC9-1vVP2US2荧光图；SC9-1：SC9-1对照荧光图。一抗为兔源抗传染性法氏囊病毒的血清。图9：Western-Blot鉴定重组病毒外源基因VP2表达图片；其中，UL45/46：YBSC9-1vVP2UL45/46感染CEF制备的蛋白样；UL41：YBSC9-1vVP2UL41感染CEF制备的蛋白样；US2：YBSC9-1vVP2US2感染CEF制备的蛋白样。SC9-1：SC9-1对照。一抗为兔源抗传染性法氏囊病毒的血清。图10：重组病毒在CEF上的生长曲线图；其中，UL45/46P20：第20代YBSC9-1vVP2UL45/46在CEF细胞上的生长曲线；UL41P20：第20代YBSC9-1vVP2UL41在CEF细胞上的生长曲线；SC9-1P20：第20代亲本毒SC9-1在CEF细胞上的生长曲线。具体实施方式本专利技术以Ⅰ型马立克氏病毒为载体，分别以其复制非必需区UL45和UL46区间，UL41区，US2区为插入位点，首先利用同源重组原理在该位点插入CMV-VP2表达框和筛选基因Kana表达框，构建表达VP2基因和Kana抗性基因的重组病毒YBSC9-1vVP2-Kana，而后将抗性基因Kana表达框诱导掉，得到只含有CMV-VP2表达框的重组MDV。本专利技术选择IBDV易邦分离株YB-IBDV201802株的完整VP2基因，将其插入pcDNA3.1(-)载体中，构建基因表达框，并通过PCR方法将该基因表达框从质粒pcDNA3.1-VP2中扩增出来，同时从PKD13质粒中扩增Kana表达框，将两表达框串联后插入到PUC19载体中，得到PUC19-VP2-Kana中间质粒。用含有不同位点同源臂的引物扩增CMV-VP2表达框和Kana表达框的串联表达框，同源重组到SC9-1基因组中，得到含有表达VP2基因和Kana抗性基因的重组MDV基因组YBSC9-1vVP2-KanaUL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达IBDV‑VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的病毒株是将VP2基因表达框插入到Ⅰ型马立克氏病毒的UL45区和UL46区之间。

【技术特征摘要】
2019.06.24 CN 201910550445X1.一种表达IBDV-VP2基因的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的病毒株是将VP2基因表达框插入到Ⅰ型马立克氏病毒的UL45区和UL46区之间。2.如权利要求1所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因表达框的插入位点位于Ⅰ型马立克氏病毒基因组UL45区和UL46区之间的103909nt-103910nt之间。3.如权利要求1或2所述的重组Ⅰ型马立克氏病毒株，其特征在于，所述的VP2基因，其编码序列的核苷酸序列为SEQIDNO:1。4.如权利要求1或2所述的重组Ⅰ型马立克氏病...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙鹏，楚电峰，侯玉超，杜元钊，范根成，刘相娥，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37