一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法技术

本发明专利技术公开了一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，所述方法将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15‑45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；与市场上的现有商品固定化脂肪酶相比较，本发明专利技术制备的固定化脂肪酶有更高的酶活力，因此酶固定化方法具有良好的工业化应用前景。

Immobilization of lipase B from Candida antarctica

【技术实现步骤摘要】
一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法(一)
本专利技术属于酶工程领域，涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法。(二)
技术介绍
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，还有此外化酯类化合物的分解、酯化、酯交换、内酯合成、肽合成、酯聚合及酰化反应等功能。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中。其中南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)是一种重要的脂肪酶。南极假丝酵母脂肪酶B广泛的应用于光学活性药物、有特殊生理功能的构造脂质、精细化学品、手性化合物和生物柴油等方面，具有巨大的应用价值。脂肪酶催化反应具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等特点。而游离态的脂肪酶作为一种蛋白质存在容易失活和催化反应不稳定的问题，反应过后也存在不易分离和分离成本高的问题。固定化脂肪酶与游离脂肪酶相比最大的优势在于：固定化脂肪酶可以重复使用、连续操作、简化和更加高效地催化反应。因此脂肪酶的固定化具有重大的市场价值。本专利技术建立了通过MOF结构ZIF-8结合CALB脂肪酶复合物，再与大孔吸附树脂交联的新型酶固定化方法。大孔吸附树脂具有良好的刚性结构和吸附能力，而且回收容易，同时会给予酶蛋白一定的保护作用。金属有机框架材料ZIF-8复合酶的大量文章(1.PitzalisF,CarucciC,NaseriM,etal.LipaseEncapsulationontoZIF-8:AComparisonbetweenBiocatalystsObtainedatLowandHighZinc/2-MethylimidazoleMolarRatioinAqueousMedium[J].ChemCatChem,2018,10(7):1578–1585.2.NadarSS,RathodVK.Encapsulationoflipasewithinmetal-Organicframework(MOF)withenhancedactivityintensifiedunderultrasound[J].EnzymeMicrobTechnol,2018,108:11-20.)表明该材料能提高酶的催化活性、热稳定性和溶剂耐受性等性质。MOFs虽然能够提高酶的很多性质，但是MOFs本身是一种粉状物质，在实验操作的过程中容易被物料吸附结合而造成流失。将MOFs与大孔吸附树脂结合能够利用大孔吸附树脂大颗粒易回收的特点，降低固定化脂肪酶流失，提高回收率。与市场上的现有商品固定化脂肪酶相比较具有更高的稳定性和酶活力，本方法制备的的固定化脂肪酶具有良好的商业价值。(三)
技术实现思路
本专利技术提供一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，将MOFs和大孔吸附树脂结合作为固定化载体，提高了酶的溶剂耐受性和批次稳定性。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，所述方法是：将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15-45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；所述交联剂为下列之一：戊二醛或聚乙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺(PEI)。进一步，所述二甲基咪唑水溶液和硝酸锌水溶液是将二甲基咪唑和硝酸锌分别与去离子水混合，在40Hz、25℃下超声30min制成，所述二甲基咪唑水溶液浓度为0.3125mol/L，所述硝酸锌水溶液浓度为5.21～12.50μmol/mL。进一步，所述南极假丝酵母脂肪酶B优选购自丹麦诺维信公司的南极假丝酵母脂肪酶B酶液，酶量为72mg/ml，酶活为4166.67U/ml(水解活性)。进一步，所述二甲基咪唑水溶液体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B重量计为130-850ml/g(优选277.78ml/g)；所述硝酸锌水溶液与二甲基咪唑水溶液体积比为25-60:1(优选40:1)。进一步，所述非极性大孔吸附树脂为下列型号之一：D101-1，XAD1600N，HPD850，XAD1180N，XAD7HP，D3520或H103，优选D101-1；所述非极性大孔吸附树脂与南极假丝酵母脂肪酶B(若以酶液形式加入，则以酶液中酶的质量计)质量比为1-10:1，优选2.3:1。进一步，所述交联剂体积用量以南极假丝酵母脂肪酶B质量计为2-17ml/g，优选11.6ml/g。优选交联剂为质量浓度25％的聚乙烯亚胺水溶液。进一步，优选交联温度为30℃。滤饼干燥温度为35℃。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术固定化脂肪酶制备条件简单，操作方便，固定化酶活力高达38.39U/mg，较现有的固定化方法具有更好的温度稳定性和溶剂耐受性。重复利用10次以后，酶活力还能保留84％以上，适合工业化生产。(四)附图说明图1固定化南极假丝酵母脂肪酶B的催化批次稳定性。图2固定化南极假丝酵母脂肪酶B的催化溶剂耐受性。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1南极假丝酵母脂肪酶B的固定化条件和脂肪酶活性测定方法将二甲基咪唑和硝酸锌分别加入去离子水中，在40Hz下分别超声20min，分别配制得到0.3125mol/L二甲基咪唑水溶液和0.3125mol/L硝酸锌水溶液。取60mL0.3125mol/L二甲基咪唑水溶液、1.5mL0.3125mol/L硝酸锌水溶液和3mL南极假丝酵母脂肪酶B酶液(丹麦诺维信公司CALB，酶量72mg/ml，4166.67U/ml)混合，获得混合酶液，在25℃、200rpm下磁力搅拌反应30min，获得含MOFs(CALB-ZIF-8)复合物的反应液。向反应液中加入0.5g大孔树脂D101-1和2.5mL质量浓度25％聚乙烯酰亚胺(PEI)水溶液，在30℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，用真空滤纸抽滤机真空抽滤，滤饼在35℃真空干燥4h，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B(记为CALB-ZIF-8@D101-1)0.258g。对固定化脂肪酶的酯化活性进行测定，得出比酶活力38.39U/mg。固定化脂肪酶酯化活力单位的定义及测定方法如下：脂肪酶酯化活力定义(U)：35℃下每小时生成1μmoL产物所需要的酶量。比酶活力的计算方式如下：X＝[V×(V1/V2)]ρ/[(m·T)·M]其中，V为通过标准曲线计算出的脂肪酸甲酯的体积(mL)；V1为反应体系总体积(mL)；V2为取出的样品体积(mL)；ρ为油酸甲酯的密度(g/ml)；T为反应的时间(h)；m为加入的固定化酶的质量(g)；M为油酸甲酯的摩尔质量(g/mol)。固定化酶的酯化活性测定反应条件：取0.02g固定化酶，加入1ml油酸，0.5ml甲醇，0.5ml有机溶剂(叔丁醇)，40μL水，在35℃，200rpm的水浴摇床中反应1小时后，取出10uL反应后的样品加到1ml的乙酸乙酯进行气相色谱检测。气相色谱条件：Agilent6890气相色谱仪，色谱柱是DB-23毛细管柱(60.0m×0.32mm×0.25μm)，FID检测器；检测条件为柱温箱温度220℃，恒温保持10min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述方法是：将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15‑45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；所述交联剂为下列之一：戊二醛或聚乙烯亚胺。

【技术特征摘要】
1.一种南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述方法是：将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与南极假丝酵母脂肪酶B混合，在25℃、200rpm磁力搅拌条件下反应30min，再加入非极性大孔吸附树脂和交联剂，在15-45℃、200rpm水浴条件下交联反应5h，真空抽滤机抽滤，滤饼干燥，获得固定化南极假丝酵母脂肪酶B；所述交联剂为下列之一：戊二醛或聚乙烯亚胺。2.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述二甲基咪唑水溶液和硝酸锌水溶液是将二甲基咪唑和硝酸锌分别与去离子水混合，在40Hz、25℃下超声30min制成。3.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述二甲基咪唑水溶液浓度为0.3125mol/L，所述硝酸锌水溶液浓度为5.21～12.50μmol/mL。4.如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法，其特征在于所述南极假丝酵母脂肪酶B为酶量72mg/ml的南极假丝酵母脂肪酶B酶液。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建永，蔡鑫勇，章银军，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33