一种CRISPR诱导RNA文库设计方法技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，包括以下步骤：步骤一、根据参考基因组生成kmer集合；步骤二、将kmer切分成kmer1和kmer2两部分，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树中，各检索树的键序列为其中kmer2对应的kmer1；步骤三、并行获取诱导RNA及其脱靶序列，该步骤中，在比对一个kmer与检索树的键序列和其中的kme2连接成的kmer时，首先将该kmer的kmer1与检索树的键序列比对，看是否满足设定条件，满足则继续比对kmer的kmer2与检索树中的kmer2。本发明专利技术提高了计算效率。

A Design Method of CRISPR Induced RNA Library

【技术实现步骤摘要】
一种CRISPR诱导RNA文库设计方法
本专利技术属于功能基因组学领域，具体涉及一种CRISPR诱导RNA文库设计方法。
技术介绍
在当前一代的基因组编辑技术中，CRISPR系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats成簇的规律间隔的短回文重复序列)与Cas9核酸酶(与CRISPR关联的RNA引导核酸酶9)的技术研究发展最快，其可以很容易地靶向几乎任何基因组位置，为基因工程的创新发展迈出了一大步。来自CRISPR系统的Cas9蛋白通过利用诱导RNA(guideRNA，gRNA，也称为向导RNA)与DNA靶序列碱基互补配对的特点将诱导RNA与蛋白的复合体定位到DNA靶序列。与目标位置下游的原间隔相邻基序(PAM)的结合有助于指导Cas9切割DNA双链，PAM是Cas9核酸酶切割DNA双链所必需的。其中诱导RNA是CRISPR-Cas系统的关键构件，由不变部分和可变部分组成，可变部分是与DNA靶序列互补的部分，可以通过人工设计可变部分实现诱导RNA与DNA不同位点的结合。CRISPR诱导RNA文库对于基因组编辑系统至关重要。随着基因组测序技术的进步，诱导RNA文库的设计对于理解基因组功能变得越来越重要。目前已经开发了许多诱导RNA设计工具，例如CRISPRDesign，Cas-OFFinder，CRISPRscan和E-CRISP，用于基因组编辑。然而，这些工具返回了独特但有重叠的诱导RNA集合，还忽略了全基因组非编码区，而且使用第三方比对工具进行脱靶序列搜索。最近，GuideScan软件改进了CRISPER诱导RNA数据库的构建。GuideScan是一个开源系统，可以从任何基因组或CRISPR核酸内切酶设计更多合成或完全定制的诱导RNA文库。此外，GuideScan软件还可以构建单引物RNA和双引物RNA数据库，且能够获得相当多的具有多个完美目标位点的诱导RNA。因此，GuideScan获得的诱导RNA比其他工具平均获得的诱导RNA具有更高的特异性。然而，GuideScan的计算成本比较高，尤其当计算诱导RNA的脱靶序列(与诱导RNA错配数不小于参数M且不大于参数Q，Q＞M)时，GuideScan的计算成本非常高。因此，将GuideScan应用于大型基因组是不切实际的。随着越来越多的真核基因组被测序或重新测序，需要更有效的工具来加速CRISPR诱导RNA文库的设计。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，有效降低设计CRISPR诱导RNA文库的计算时间开销。一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，包括以下步骤：步骤一、在参考基因组中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer，构成kmer集合，即可靶向的基因组空间；步骤二、对kmer集合中的每一个kmer，将其切分成kmer1和kmer2两部分，其中kmer1为其前n个碱基组成的序列，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别，将一个类别的kmer2对应的kmer1作为该类别kmer2的键序列；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树(字典树)中，由此多个检索树(数据任务分成一系列的小任务)，每个检索树的键序列为相应类别的kmer2的键序列；对kmer集合中的每一个kmer，若其以非标准PAM为前缀或后缀，或其在参考基因组中的出现次数大于1，或存在与其汉明距离小于M的kmer，则其为非诱导RNA，否则为诱导RNA；步骤三、将所有的诱导RNA按照kmer1分类，对所有类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer；其中，对一个类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer的方法具体为：首先计算该类别诱导RNA的kmer1与各个检索树的键序列的汉明距离，找出键序列与该类别候选诱导RNA的kmer1的汉明距离不大于Q的检索树；然后，针对该类别的每一个候选诱导RNA，分别在找出的检索树中，搜索与该候选诱导RNA的kmer2的汉明距离不大于Q-m的kmer2；将这些kmer2分别与它们所在的检索树的键序列连接在一起构成多条kmer，参考基因组中与这些kmer互补配对的序列即为该诱导RNA的脱靶序列(参考基因组中的DNA序列为双链结构，其一条链上的碱基与另一条链上相应位置的碱基互补配对，若一条链上的kmer序列与诱导RNA的汉明距离不小于M且不大于Q，则另一条链上相应位置的kmer序列与诱导RNA的错配数不小于M且不大于Q，是诱导RNA的脱靶序列；在步骤一中记录扫描出的kmer在参考基因组的DNA序列上的坐标；在此步骤中，搜索出满足条件的kmer后，根据其在DNA序列上的坐标，可以快速在DNA序列上找到与之位置相应的kmer序列，即与之互补配对的kmer序列)；由此获得的诱导RNA及其脱靶序列信息即CRISPR诱导RNA文库。上述步骤采用了数据预处理优化算法，由于每个类别的诱导RNA的kmer1都相同，每个检索树中kmer2的键序列也都相同，先将诱导RNA分类，再比对一个类别诱导RNA的kmer1与检索树的键序列，大大减少了诱导RNA都与kmer比对的计算量和时间开销，避免了每个诱导RNA与每个kmer一一进行全序列比对。且当某个类别诱导RNA的kmer1与某个检索树键序列的汉明距离m大于Q时，该类别诱导RNA的kmer2将不需要再与该检索树中的kmer2进行比对，再次减少了计算量和时间开销。进一步地，所述步骤一中，并行在参考基因组的多个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer。进一步地，将在参考基因组的多个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer作为一个总任务，将其划分为多个子任务，每个子任务即在参考基因组的一个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer；采用python的多进程模块中的进程和队列方法模拟进程池功能，并行执行多个子任务。进一步地，所述步骤二中，并行将多个类别的kmer2分别构建到多个检索树中。进一步地，把将多个类别的kmer2分别构建到多个检索树中作为一个总任务，将其划分为多个子任务，每个子任务即将一个类别的kmer2构建到一个检索树中；采用python的多进程模块中的进程和队列方法模拟进程池功能，并行执行多个子任务。进一步地，所述步骤二中，并行遍历所有检索树，判断其中每一个kmer2与其所在的检索树的键序列连接成的kmer在参考基因组中的出现次数是否大于1。进一步地，将遍历所有检索树，判断其中每一个kmer2与其所在的检索树的键序列连接成的kmer在参考基因组中的出现次数是否大于1作为一个总任务，将其划分为多个子任务，每个子任务即遍历一个检索树，判断其中每一个kmer2与其所在的检索树的键序列连接成的kmer在参考基因组中的出现次数是否大于1；采用python的多进程模块中的进程和队列方法模拟进程池功能，并行执行多个子任务。进一步地，所述步骤二中，在对kmer集合中的每一个kmer，若其以非标准PAM为前缀或后缀，或其在参考基因组中的出现次数大于1，则其为非诱导RNA，否则其为候选诱导RNA；将所有的候选诱导RNA按本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、在参考基因组中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer，构成kmer集合；步骤二、对kmer集合中的每一个kmer，将其切分成kmer1和kmer2两部分，其中kmer1为其前n个碱基组成的序列，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别，将一个类别的kmer2对应的kmer1作为该类别kmer2的键序列；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树中，由此多个检索树，每个检索树的键序列为相应类别的kmer2的键序列；对kmer集合中的每一个kmer，若其以非标准PAM为前缀或后缀，或其在参考基因组中的出现次数大于1，或存在与其汉明距离小于M的kmer，则其为非诱导RNA，否则为诱导RNA；步骤三、将所有的诱导RNA按照kmer1分类，对所有类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer；其中，对一个类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer的方法具体为：首先计算该类别诱导RNA的kmer1与各个检索树的键序列的汉明距离，找出键序列与该类别候选诱导RNA的kmer1的汉明距离不大于Q的检索树；然后针对该类别的每一个候选诱导RNA，分别在找出的检索树中，搜索与该候选诱导RNA的kmer2的汉明距离不大于Q‑m的kmer2；将这些kmer2分别与它们所在的检索树的键序列连接在一起构成多条kmer，参考基因组中与这些kmer互补配对的序列即为该诱导RNA的脱靶序列；由此获得的诱导RNA及其脱靶序列信息即CRISPR诱导RNA文库。...

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、在参考基因组中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer，构成kmer集合；步骤二、对kmer集合中的每一个kmer，将其切分成kmer1和kmer2两部分，其中kmer1为其前n个碱基组成的序列，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别，将一个类别的kmer2对应的kmer1作为该类别kmer2的键序列；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树中，由此多个检索树，每个检索树的键序列为相应类别的kmer2的键序列；对kmer集合中的每一个kmer，若其以非标准PAM为前缀或后缀，或其在参考基因组中的出现次数大于1，或存在与其汉明距离小于M的kmer，则其为非诱导RNA，否则为诱导RNA；步骤三、将所有的诱导RNA按照kmer1分类，对所有类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer；其中，对一个类别的诱导RNA，遍历所有检索树，搜索与其汉明距离小于不大于Q的kmer的方法具体为：首先计算该类别诱导RNA的kmer1与各个检索树的键序列的汉明距离，找出键序列与该类别候选诱导RNA的kmer1的汉明距离不大于Q的检索树；然后针对该类别的每一个候选诱导RNA，分别在找出的检索树中，搜索与该候选诱导RNA的kmer2的汉明距离不大于Q-m的kmer2；将这些kmer2分别与它们所在的检索树的键序列连接在一起构成多条kmer，参考基因组中与这些kmer互补配对的序列即为该诱导RNA的脱靶序列；由此获得的诱导RNA及其脱靶序列信息即CRISPR诱导RNA文库。2.根据权利要求1所述的CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，所述步骤一中，并行在参考基因组的多个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer。3.根据权利要求2所述的CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，将在参考基因组的多个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer作为一个总任务，将其划分为多个子任务，每个子任务即在参考基因组的一个序列中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer；采用python的多进程模块中的进程和队列方法模拟进程池功能，并行执行多个子任务。4.根据权利要求1所述的CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，所述步骤二中，并行将多个类别的kmer2分别构建到多个检索树中。5.根据权利要求4所述的CRISPR诱导RNA文库设计方法，其特征在于，把将多个类别的kmer2分别构建到多个检索...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建新，李涛，王劭恺，严承，李敏，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43