一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术披露了一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，其中基因包括HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2，其甲基化胞嘧啶位点依次标定在序列表中序列1、序列2、序列3以及序列4中。检测试剂盒包括：检测HOXA7基因的试剂，含编号1‑1、1‑2序列所示的引物及编号1‑3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2‑1、2‑2序列所示的引物及编号2‑3序列所示的探针；检测SCT的试剂，含编号3‑1、3‑2序列所示的引物及编号3‑3序列所示的探针；以及含编号3‑4、3‑5序列所示的引物及编号3‑6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4‑1、4‑2序列所示的引物及编号4‑3序列所示的探针。

A Methylation Gene Associated with Lung Cancer and Its Detection Kit

【技术实现步骤摘要】
一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒
本专利技术涉及检测基因的试剂，尤其涉及与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒。
技术介绍
肺结节为小的局灶性、类圆形、影像学表现密度增高的阴影，可单发或多发，不伴肺不张、肺门肿大和胸腔积液。形成肺部结节的病因很多，基本分为良性结节和恶性结节两大类，良性结节为良性肿瘤、结核病、结节病或炎性结节等。恶性结节包括肺癌及转移性肿瘤等，肺癌的发生经历增生-不典型增生-原位癌-浸润性癌等一系列阶段，其规律是起初发展较慢，待发展到一定阶段速度迅速增加。恶性肺结节中肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，根据2017年2月，国家癌症中心发布的中国最新癌症数据可知，肺癌的发病率、死亡率双率第一(大中小城市的肺癌死亡率都在40％～54％之间)，是第二名其它癌症双率的一倍左右，死亡率之高，位居2017年癌症之首。对于肺癌，早期诊断及早期治疗是改善预后的最有效方法，如果及早处理，早期肺癌患者可以期待更高的5年生存率，目前I期肺癌5年总体生存率可达80％。然而相对于早期肺癌患者，进展期肺癌的患者临床结局就差的多，甚至IV期的肺癌患者，总体5年生存率仅为10％左右。因此，有效地对肺部结节进行鉴别诊断，快速明确其良恶性，尽早切除恶性结节，同时避免不必要的过度治疗，是肺部结节诊断治疗的关键。近年来肺癌表观遗传学研究进展对肺癌的早期诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制，不同基因的转录失活将影响细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等，与癌症的发生发展有着密切联系。基因甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶(C)在酶的作用下选择性地添加甲基形成5’-甲基胞嘧啶的过程。在肺癌患者中，基因启动子区的CpG岛甲基化是一个较为普遍的现象。临床认为，对肺癌患者的组织细胞和体液(如痰液、血清及血浆等)进行甲基化基因标志物的检测，是一项有效的肺癌辅助检测方法，具有提高肺癌检出率的价值。有研究表明，在肺癌确诊的3年前就可以从患者的痰液中检测出DNA的甲基化。如果将其与细胞病理学的检测结合起来，可大大提高肺癌诊断的效率，缩短检测周期，提高诊断的准确性。甲基化基因标志物在良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断中有着重要意义。目前已报道的肺癌相关的甲基化基因标志物尚具敏感度低(35.5％)和特异性低(73％)的缺陷，使之应用于临床检测存在一定的局限。在此，需要简单介绍一下相关知识：甲基化基因标志物针对某一或某些癌症的敏感度高，表示相应癌症的漏诊率低；类似地，其特异性高则表示相应癌症的误诊率低。故可知，甲基化基因标志物检测的敏感度、特异性是衡量其参考价值大小的两项重要指标。综上所述，对甲基化基因标志物进行进一步深入研究，找到高敏感度、高特异性的与肺癌相关的甲基化基因及其组合的检测试剂，从而为良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断的准确性和良好预后提供更有效的手段，是当前甲基化基因标志物检测技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，能够通过其高敏感度、高特异性为良恶性肺结节鉴别或肺癌诊断提供有价值的参考信息。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种与肺癌相关的甲基化基因，包括HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其中，基因HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在序列1、序列2、序列3及序列4中。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种如前所述基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，包括以下试剂中的一种或多种：检测HOXA7基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2-1、2-2序列所示的引物以及编号2-3序列所示的探针；检测SCT基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针。优选地，检测试剂盒还包括用于内参基因检测的ACTB引物和探针。优选地，待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液及肺部组织样本中的一种或多种，此外，还包含支气管刷检样本。优选地，HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：0.2μM基因相应的引物组，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。优选地，将检测试剂盒的试剂中的任意两个进行组合，或将试剂中的任意三个进行组合，或将四个试剂进行组合，分别构成组合试剂盒。优选地，HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：组合中的基因相应的引物组均设为0.2μM，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U的DNA聚合酶，用于阳性对照的非小细胞HCC827细胞系计数后提取的DNA，以及用于阴性对照的灭菌水。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种获取如前所述基因的方法，包括：对待测样本进行全基因组甲基化阵列分析，筛选出的与良恶性肺结节鉴别或肺癌相关的159种候选基因；从候选基因中选出靶标基因HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2，分别针对靶标基因的甲基化DNA特异性片段设计相应的引物和探针，设计的引物和探针分别等同于、互补于或杂交于序列表序列1-4中至少15个连续核苷酸或其互补序列，获取并验证符合检测要求的靶标基因的性能指标。优选地，该方法中提到的靶标基因的性能指标包括：敏感度、特异性及接受者操作特征曲线下面积AUC值。优选地，该方法中提到的待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液、肺部组织及支气管刷检样本中的一种或多种。本专利技术提供的与肺癌相关的甲基化基因及其检测试剂盒，由于试剂盒里的试剂包括HOXA7、HOXA9、SCT、SHOX2四种甲基化基因标志物中的一种或多种相应的引物组，通过对检测样本进行全基因组甲基化阵列分析，从筛选出159个候选基因中甄选出的具特殊位点的甲基化基因标志物，其敏感度、特异性之高是已有的甲基化基因检测所不具备的，并且将这四种甲基化标志物进行不同的组合，可进一步提高其敏感度、特异性，从而能够为良恶性肺结节鉴别和肺癌诊断的准确性和预后良好提供有价值的参考信息。附图说明图1表示了本专利技术提供的检测甲基化基因HOXA7的ROC曲线；图2表示了本专利技术提供的检测甲基化基因HOXA9的ROC曲线；图3表示了本专利技术提供的检测甲基化基因SCT的ROC曲线；图4表示了本专利技术提供的检测甲基化基因SHOX2的ROC曲线。具体实施方式以下结合优选实施例对本专利技术的技术方案进行详细地阐述。应该指出，以下例举的实施例仅用于说明和解释本专利技术，而不构成对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与肺癌相关的甲基化基因，包括基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其特征在于，所述基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在所述序列1、序列2、序列3及序列4中。

【技术特征摘要】
1.一种与肺癌相关的甲基化基因，包括基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2中的一个或多个，其核苷酸序列依次如序列表中序列1、序列2、序列3及序列4所示；其特征在于，所述基因HOXA7、HOXA9、SCT及SHOX2的甲基化胞嘧啶位点依次标定在所述序列1、序列2、序列3及序列4中。2.一种如权利要求1所述基因的检测试剂盒，用于检测待测样本中的甲基化基因，包括以下试剂中的一种或多种：检测HOXA7基因的试剂，含编号1-1、1-2序列所示的引物以及编号1-3序列所示的探针；检测HOXA9基因的试剂，含编号2-1、2-2序列所示的引物以及编号2-3序列所示的探针；检测SCT基因的试剂，含编号3-1、3-2序列所示的引物以及编号3-3序列所示的探针；含编号3-4、3-5序列所示的引物以及编号3-6序列所示的探针；检测SHOX2基因的试剂，含编号4-1、4-2序列所示的引物以及编号4-3序列所示的探针。3.按照权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括用于内参基因检测的ACTB引物和探针。4.按照权利要求3所述的检测试剂盒，所述待测样本包含人体血液、肺泡灌洗液、肺泡冲洗液、痰液及肺部组织样本中的一种或多种，其特征在于，该待测样本还包含支气管刷检样本。5.按照权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述HOXA7、HOXA9、SCT以及SHOX2基因相应的引物组分别由各自试剂中含有的引物及探针组成，在PCR反应液里各成分浓度依次为：0.2μM基因相应的引物组，0.6μMACTB引物和探针，3.5mMMgCl2、0.25mMdNTP；此外，还含有用量为100U...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹，江南，刘代新，
申请(专利权)人：苏州呼呼健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32