用于全面细胞裂解的组合裂解方案制造技术

本发明专利技术公开了用于裂解细胞(例如存在于微生物组中的细菌)的方法，其将三个裂解步骤(1)加热、(2)洗涤剂和(3)碱组合成一步，并且可以在短时间内完成，例如几分钟。该方法结合了通常不相容的洗涤剂裂解和碱裂解，允许在裂解后简化洗涤剂的去除，并且重要的是，提高了从难以裂解的细菌中产生基因组DNA(gDNA)的量。

Combinatorial lysis scheme for total cell lysis

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于全面细胞裂解的组合裂解方案
公开了用于裂解细胞以从细胞内部释放或提取基因组DNA(gDNA)的方法。所公开的方法将加热、洗涤剂和碱组合在单个管中，并且可以在几分钟内完成。该方法组合了通常不相容的洗涤剂和碱，有助于裂解后去除洗涤剂，而无需额外的步骤，并且该组合在无顺序处理的方案中产生了意想不到的协同作用，大大减少了步骤的数量和手动操作时间，同时提高了gDNA的表现性(representation)，例如，从微生物组样品中难以裂解的细菌中。
技术介绍
许多基于细胞和基于DNA的分析方法需要从细胞内部释放DNA以促进分析。打开细胞以释放DNA被称为‘裂解’。例如，使用DNA测序技术研究微生物组的方法首先需要裂解微生物，以便可以提取DNA。大多数微生物组是细菌、古细菌和真菌的群落，它们对裂解技术的敏感性(susceptibility)差别很大。差异的易感性对研究人员来说是一个重大问题，研究人员希望确保最难裂解的细菌(通常是革兰氏阳性)和最容易裂解的细菌(通常是革兰氏阴性)与它们在原始样本中的数量成比例。遗憾的是，大多数微生物裂解方案对某些微生物很有效，但对其它微生物则很差。此外，用于回收质粒DNA的快速且简单的碱裂解技术通常也会去除微生物的基因组DNA，而基因组DNA正是微生物组筛选的目标(AlkalineLysisopenscellsbutremovesgDNA-Birnboim,H.C.andDoly,J,ArapidalkalineextractionprocedureforscreeningrecombinantplasmidDNA,NucleicAcidsRes.7(6),1979,1513-1524；KOHlysisrecoversbacterialgenomicDNA-Raghunathan,Arumughametal."GenomicDNAAmplificationfromaSingleBacterium."AppliedandEnvironmentalMicrobiology71.6(2005):3342-3347.PMC.Web.29Sept.2016)。存在本领域已知的基于不同的生物化学方法攻击细胞完整性的多种裂解技术，包括溶菌酶(对肽聚糖细胞壁的酶促攻击)、强碱(化学攻击)、洗涤剂(溶解细胞膜)、珠磨(beadbeating)或摇动(机械破碎)和加热(Comparisonoflysistechniquesformicrobiome-SanqingYuan,DoraB.Cohen,JacquesRavel,ZaidAbdo,LarryJ.Forney.EvaluationofMethodsfortheExtractionandPurificationofDNAfromtheHumanMicrobiome.PLoSONE7(3):e33865.doi:10.1371/journal.pone.0033865；DNAextractionmethodsaffectmicrobiomeprofilingresults:WagnerMackenzieB,WaiteDW,TaylorMW.EvaluatingvariationinhumangutmicrobiotaprofilesduetoDNAextractionmethodandinter-subjectdifferences.FrontiersinMicrobiology.2015；6:130.doi:10.3389/fmicb.2015.00130)。大多数公开的或商业上可获得的DNA制备方法使用这些方法中的一种或多种来裂解细胞，通常在顺序步骤中，这些方法可能花费大量时间的，特别是在一次处理多个样品时。虽然个别的裂解方法通常足以应用于不完全或部分裂解产生足够的DNA，用于正在执行的方案，但它们通常不会与原始群落成比例地从微生物组样品中产生DNA，并且可能不能完全裂解某些微生物。例如，基于洗涤剂的裂解可以破坏具有弱细胞壁和强细胞膜的细胞亚群，但不会打开具有强细胞壁的耐洗涤剂微生物，导致在所得DNA制备中，耐洗涤剂细胞中DNA的不充分表现或缺乏。在另一个示例中，微生物的珠磨足以裂解具有强细胞膜的细胞，其可以剪切或破坏在该过程早期从易于裂解的细胞释放的DNA。另外，各种裂解方法往往彼此不相容，并且如果组合使用，则需要顺序进行。例如，溶菌酶在洗涤剂或强碱的存在下不起作用。某些洗涤剂在强碱的存在下会沉淀。珠磨难以与加热过程组合。虽然可以通过连续运行单独的裂解方案以克服个别的缺点，但这增加了所涉及的复杂性、时间和成本。重要的是，在裂解后必须去除洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，因为SDS会干扰下游的DNA操作(manipulation)。另外，取决于方案顺序，某些微生物可能对顺序运行的裂解方案具有抗性。例如，具有坚韧的肽聚糖细胞壁的某些微生物可能具有脂质双层的外包膜，其保护免受强碱或溶菌酶的初始处理。只有多种方法的同时组合可能是有效的，或者是多个步骤的长顺序可能是有效的，以从样品中的所有微生物产生DNA。本文公开的方法通过将多种裂解方法组合成简单、快速的方案来简化用于需要或必须比例裂解的应用和技术(如微生物组的研究)的裂解，该方案在含有不同细胞成分(例如微生物组)的样品中产生更具表现性的DNA谱。
技术实现思路
公开了用于裂解细胞(例如存在于微生物组中的细菌)的方法，其将三个裂解步骤(1)加热、(2)洗涤剂和(3)碱组合成一步，并且可以在短时间内完成，例如几分钟。该方法组合了通常不相容的洗涤剂裂解和碱裂解，允许在裂解后简化洗涤剂的去除，并且重要的是，提高了从难以裂解的细菌中产生基因组DNA(gDNA)的量。本文公开了用于裂解样品中细胞，以从细胞中释放DNA的方法，包括：(a)将含有生物细胞的水溶液与(i)离子型洗涤剂和(ii)能够沉淀所述离子型洗涤剂的碱混合；(b)将该水溶液加热至至少50℃一段时间，以有效溶解离子型洗涤剂；(c)将该水溶液冷却至40℃或更低一段时间，以有效沉淀离子型洗涤剂；和(d)从水溶液中分离沉淀物，其中在分离沉淀物后，从生物细胞中释放的DNA存在于水溶液中。在一些实施方案中，离子型洗涤剂选自由以下项组成的组：十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸钠盐或脱氧胆酸钠。在一些实施方案中，离子型洗涤剂的浓度为约0.1％至约10％。在一些实施方案中，离子型洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，浓度为约1％。在一些实施方案中，碱选自由以下项组成的组：氢氧化钾(KOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化锶(Sr(OH)2)、和氢氧化钡(Ba(OH)2)。在一些实施方案中，碱的浓度为约0.05摩尔至约1摩尔。在一些实施方案中，碱为氢氧化钾(KOH)，浓度为约0.2mol。在一些实施方案中，将洗涤剂与碱组合，该碱在低温下沉淀该洗涤剂，但允许在高温下溶解该洗涤剂。在一些实施方案中，离子型洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，浓度为1wt％，以及碱为含有氢氧化钾(KOH)的水溶液，浓度为0.2mol。在一些实施方案中，加热在约50℃至约100℃的温度范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于裂解样品中的生物细胞以从细胞中释放DNA的方法，包括以下顺序步骤：a.将含有生物细胞的水溶液与(ⅰ)离子型洗涤剂和(ii)有效促进离子型洗涤剂沉淀的碱混合；b.将所述水溶液加热至至少50℃一段时间，以有效溶解离子型洗涤剂；c.将所述水溶液冷却至40℃或更低一段时间，以有效沉淀离子型洗涤剂；和d.从所述水溶液中分离沉淀物，其中在分离沉淀物之后，从生物细胞释放的DNA存在于所述水溶液中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.29 US 62/440,1711.用于裂解样品中的生物细胞以从细胞中释放DNA的方法，包括以下顺序步骤：a.将含有生物细胞的水溶液与(ⅰ)离子型洗涤剂和(ii)有效促进离子型洗涤剂沉淀的碱混合；b.将所述水溶液加热至至少50℃一段时间，以有效溶解离子型洗涤剂；c.将所述水溶液冷却至40℃或更低一段时间，以有效沉淀离子型洗涤剂；和d.从所述水溶液中分离沉淀物，其中在分离沉淀物之后，从生物细胞释放的DNA存在于所述水溶液中。2.权利要求1所述的方法，其中所述离子型洗涤剂选自由以下项组成的组：十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸钠盐和脱氧胆酸钠。3.权利要求2所述的方法，其中所述离子型洗涤剂的浓度为约0.1wt％至约10wt％。4.权利要求1所述的方法，其中所述离子型洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，浓度为约1wt％。5.权利要求1所述的方法，其中所述碱选自由以下项组成的组：氢氧化钾(KOH)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化铷(RbOH)、氢氧化铯(CsOH)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化锶(Sr(OH)2)和氢氧化钡(Ba(OH)2)。6.权利要求5所述的方法，其中所述碱的浓度为约0.05mol至约1mol。7.权利要求1所述的方法，其中所述碱是氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·德里斯科尔，T·贾维，
申请(专利权)人：海岸线生物群有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US