用于上调人DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株制造技术

本发明专利技术公开了一种用于上调人DLK1‑DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株。sgRNA序列如SEQ ID NO.1，具体为5’‑TTTATATGGAGGCGCAGAAG‑3’；方法合成为，合成sgRNA序列的核酸片段并插入到MS2‑P65‑HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化，选择单克隆菌株，提取MS2‑P65‑HSF1‑sgRNA‑DLK1‑DIO3重组质粒，将重组质粒转染到已预先转染dCAS9‑VP64质粒的目的细胞株，得到上调DLK1‑DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株。本发明专利技术能快速、简便、准确上调细胞株中DLK1‑DIO3印记域上非编码RNA的表达。

SgRNA, recombinant plasmid and cell strain used to up-regulate the expression of non-coding RNA in human DLK1-DIO3 imprinting domain

【技术实现步骤摘要】
用于上调人DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株
本专利技术涉及基因编辑及其应用，特别涉及用于上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的专用sgRNA引物序列及其应用。技术背景基因编辑技术是近年来发展起来的一项基因组修饰技术，可在基因组特定位点进行InDel突变、敲入、多位点突变、小片段删除、以及片段替换等操作。在科学研究领域，基因编辑技术可用于模式生物的快速构建，如特定基因敲除小鼠的构建；在农业领域，该技术可用于动植物品种的优化改造；而在医疗卫生领域，该技术还有可能通过改造人类自身基因，从源头上治疗疾病的目的。因此，基因编辑技术具有极其广泛的应用价值和发展前景。CRISPR/Cas属于第三代基因编辑技术，其来源于天然存在的原核生物适应性免疫系统。2012年8月，美国加州大学伯克利分校和德国汉诺威医学院的研究人员在《Science》杂志上发表文章，首先报道了该系统的工作原理，其主要可通过向导RNA序列(即sgRNA)的引导来实现对特定基因的编辑。CRISPR/Cas系统经过多年发展，可实现多个哺乳动物系统内高效可靠的RNA导向基因组修饰，从而大幅提高了基因组编辑以及基因组调控的便捷程度。最初发表的有关CRISPR系统的文章，介绍的全都是如何利用CRISPR系统切割DNA的工作。Qi和Jaenisch等人最近构造了一个融合激活蛋白(VP48、VP64、VP96、p65)的无核酸酶活性Cas9蛋白(dCas9-VP64)，通过sgRNA靶向基因启动子序列，激活蛋白募集转录因子，从而可以增强下游靶基因的表达。Jaenisch等将此技术命名为“CRISPR-on”技术(www.crispr-on.org)。DLK1-DIO3印记域非编码RNA和肿瘤的发生与进展有关，特别是母系表达印记基因(主要是非编码RNA:如miRNAs和少量一些lncRNAs)。这些非编码RNA的转录方向一致，且具有共同的印记调控区基因间DMR(IG-DMR)。在已有的研究中，大多数报道均提示DLK1-DIO3印记域的非编码RNA在肿瘤中的表达受到抑制，提示其可能发挥抑癌作用。因此能够利用CRISPR-on系统全面上调它们的转录和表达，其关键在于sgRNA设计和有效性。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术目的为利用CRISPR-on技术，鉴于DLK1-DIO3印记域的非编码RNA的成簇分布和同时转录的特征，提供设计了一种针对DLK1-DIO3印记域的特异性sgRNA序列，能快速、简便、准确上调细胞株中DLK1-DIO3印记域上非编码RNA的表达，可进一步利用CRISPR-on系统全面上调它们的转录和表达。本专利技术的另一目的为提供了一种MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。本专利技术还提供了上调DLK1-DIO3印记域上非编码RNA表达的细胞株。本专利技术的技术方案如下：一、一种针对DLK1-DIO3印记域启动子区设计的sgRNA序列：序列如SEQIDNO.1，具体为5’-TTTATATGGAGGCGCAGAAG-3’，这一sgRNA命名为sgRNA(DLK1-DIO3)。定位于DLK1-DIO3印记域上非编码RNA转录起始位点上游-32～-13，长度为20nt。上述sgRNA序列5’端第一个碱基必须是G，若第一个碱基不是G，则需自行在前面加一个碱基G，正向引物需添加CACC作为接头，反向引物则需添加AAAC作为接头，靶标区域的sgRNA序列确定后，以sgRNA序列为模版设计与其互补的链。所述的sgRNA(DLK1-DIO3)特异性地靶向DLK1-DIO3印记域启动子区，在预转染dCAS9-VP64质粒的目的细胞株中上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA的表达量。本专利技术包括所述sgRNA序列在上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达量上的应用。本专利技术包括包含如权利要求1所述的sgRNA序列的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。本专利技术包括所述MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒的构建方法，是将所述的sgRNA插入到MS2-P65-HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化，转化是指克隆扩增，得到MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。本专利技术包括所述的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒在制备上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株中的应用。二、一种上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株的构建方法，包括以下步骤：(1)合成权利要求1所述的sgRNA序列；(2)将步骤(1)中合成的核酸片段插入到MS2-P65-HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化，选择单克隆菌株，提取MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒，并测序鉴定获得测序正确的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒；(3)将步骤(2)中得到的所述MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒转染到已预先转染dCAS9-VP64质粒的目的细胞株，得到上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株。另外本专利技术还包括上述方法构建获得的上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株。本专利技术所述的细胞株优选为人膀胱癌细胞株。本专利技术的有益效果是：本专利技术设计构建的特异性sgRNA序列能够靶向DLK1-DIO3印记域启动子区，进一步基于CRISPR-on系统能快速、简便、准确上调细胞株中DLK1-DIO3印记域上非编码RNA的表达。附图说明图1MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒构建过程示意图；图2为判断膀胱癌UM-UC-3细胞中DLK1-DIO3印记域上非编码RNA表达水平。由于DLK1-DIO3印记域上的非编码RNA包含多达50余个miRNA，本实验随机选取了部分miRNA进行了定量检测，包括miR-300,miR-323B,miR-381,miR-409,miR-433,miR-487A和miR-539。统计学检验判定这些位于DLK1-DIO3印记域上的非编码RNA的表达水平均发生显著上调。具体实施方式下面结合具体实施进一步阐述本专利技术，应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。本专利技术具体实施例如下：培养生长状态良好的膀胱癌UM-UC-3细胞，病毒感染前一天将UM-UC-3细胞铺板，感染当天按实验设计的组别加入dCAS9-VP64慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后进行Puromycine筛选，之后感染sgRNA(DLK1-DIO3)慢病毒，G418筛选，收集细胞检测或进行相关功能学研究。实验材料i.试剂培养基(DMEM,Hyclone)、胎牛血清(FBS)、PBS液、胰酶、DMSO、RNAisoforSmallRNA、OneStepmiRNAcDNASynthesisKit、PremixExTaqTMII、引物、氯仿、乙醇、异丙醇。ii.仪器：移液器(1000μl，200μl，Gilson；100ml，BIOHIT)、CO2培养箱、倒置显微镜、生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对DLK1‑DIO3印记域启动子区设计的sgRNA序列，其特征在于：序列如SEQ ID NO.1，具体为5’‑TTTATATGGAGGCGCAGAAG‑3’，这一sgRNA命名为sgRNA(DLK1‑DIO3)。

【技术特征摘要】
1.一种针对DLK1-DIO3印记域启动子区设计的sgRNA序列，其特征在于：序列如SEQIDNO.1，具体为5’-TTTATATGGAGGCGCAGAAG-3’，这一sgRNA命名为sgRNA(DLK1-DIO3)。2.一种如权利要求1所述sgRNA序列在上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达量上的应用。3.一种MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含如权利要求1所述的sgRNA序列。4.一种如权利要求3所述MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒的构建方法，其特征在于：将所述的sgRNA插入到MS2-P65-HSF1表达质粒载体的多克隆位点，得到MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。5.权利要求3所述的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐鑫，郑祥义，王潇，陈世明，李江枫，颜华卿，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33