一种组织蛋白酶S的底物、其应用和包含其的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开一种组织蛋白酶S的底物，其包括特定序列的氨基酸和荧光基团，组织蛋白酶S对该底物具有高度特异性和催化活性。故该底物可用于组织蛋白酶S活性的定量分析。本发明专利技术还提供包含该底物的试剂盒，可通过吸取泪液并测定泪液中组织蛋白酶S的含量来进行干燥综合征的诊断。

A Cathepsin S Substrate, Its Application and Kit Containing Cathepsin S

【技术实现步骤摘要】
一种组织蛋白酶S的底物、其应用和包含其的试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种组织蛋白酶S的底物、其应用以及包含其的试剂盒。
技术介绍
干燥综合征(Sjogren’sSyndrome)为全身性自身免疫疾病，在我国人群的患病率为0.3％～0.7％，在老年人群中患病率为3％～4％。本病女性多见，男女比为1：9～20。发病年龄多在40岁～50岁。也见于儿童。该疾病给患者带来不同程度的健康损害包括角膜结膜口腔极度干燥，多器官功能障碍，严重情况下可导致失明，甚至增加恶性淋巴瘤的发病率。目前干燥综合症仍然没有根治的方法，但及时就医确诊并使用相应的免疫调节药物可以使病情得到有效的控制。目前有研究发现干燥综合征患者眼泪中组织蛋白酶S表达显著升高，使得通过检测组织蛋白酶S的含量来确诊干燥综合征成为可能。组织蛋白酶S能够切割特定的底物序列，基于此，其检测方法一般是在特定的底物序列上标记荧光基团，通过组织蛋白酶的切割释放该荧光基团以发光，并通过荧光检测仪器检测其荧光强度。现有组织蛋白酶S底物的特异性和催化活性仍不理想。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供一种高特异性和催化活性的组织蛋白酶S的底物，并提供包含该底物的用于诊断干燥综合征的试剂盒。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：组织蛋白酶S特异性底物，名称为Ac-PMKVR-AMVTC，其中PMKVR为氨基酸序列：脯氨酸-蛋氨酸-赖氨酸-缬氨酸-精氨酸，该底物的结构如下式所示：较同一家族的其它蛋白酶，组织蛋白酶S对该底物具有更强的特异性和催化活性(约为其他蛋白酶的100倍)，只需极少量的泪液样品即可精确检测组织蛋白酶S的活性，同时避免其他蛋白酶酶解带来的误差。该底物分子在激发光下不产生发射光，酶解后形成的产物分子7-氨基-4-甲基-3-乙烯甲苯香豆素(AMVTC)可被393mn激发光激发产生480nm波长的蓝色荧光发射光，用于酶活性分析的定量物，该分子中的荧光基团具有接近完美的光子转换效率，其φ值为0.98，即该分子所吸收的98％的激发光子可以转换成发射光子。本专利技术还提供上述底物在制备干燥综合征诊断试剂盒中的应用，通过该底物精确检测组织蛋白酶S的活性，以诊断患者是否患有干燥综合征。所述试剂盒中该底物原液浓度为10mM。本专利技术还提供一种干燥综合征诊断试剂盒，包括上述底物，还包括酶反应溶液、组织蛋白酶S抑制剂、产物标准液和样品采集器。将泪液样品在含有底物的酶反应溶液中孵育，反应液的荧光强度与产物(7-氨基-4-甲基-3-乙烯甲苯香豆素，缩写为AMVTC)标准液(0.1mM)的系列荧光强度制成的标准曲线进行对比而得到样品中组织蛋白酶S的活性，组织蛋白酶S抑制剂可选择性与组织蛋白酶S结合，使其失去催化活性，用于确认实验检测到的荧光强度由组织蛋白酶S所催化产生。可选地，所述酶反应溶液中包括：50mM磷酸钾缓冲液，50mMNaCl，2mMEDTA，0.01wt％TritonX-0.5mM二硫苏糖醇，pH6.5。可选地，所述组织蛋白酶S抑制剂为1mM的Z-FL-COCHO或Z-FF-FMK。可选地，所述眼泪样品采集器为酚红棉线。本专利技术试剂盒可通过检测泪液中组织蛋白酶S的含量来诊断干燥综合征，用酚红棉线来吸取泪液比希尔默试纸条时间更短更方便。附图说明图1是本专利技术实施例2中标准曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本实施例提供一种组织蛋白酶S的底物，名称为Ac-PMKVR-AMVTC，其结构如下式所示：实施例2一种干燥综合征诊断试剂盒，包括实施例1的底物溶液(10mM)，酶反应溶液、Z-FL-COCHO(1mM)、AMVTC标准液(0.1mM)和酚红棉线。其中酶反应液中包括：50mM磷酸钾缓冲液，50mMNaCl，2mMEDTA，0.01wt％TritonX-0.5mM二硫苏糖醇，pH6.5。酚红棉线上刻有刻度，吸取泪液后取2mm作为样品即可。该试剂盒的使用方法如下：配制浓度分别为0、200pmol/100μl、400pmol/100μl、600pmol/100μl、800pmol/100μl、1000pmol/100μl和1200pmol/100μl的AMVTC标准液，使用荧光酶标仪测定以上各已知浓度的AMVTC溶液的荧光蓝色强度(激发光393nm/发射光480nm)。然后用测得的荧光强度对已知浓度做标准曲线，结果如图1所示。用酚红棉线吸取泪液，酚红棉线上具有刻度，吸取泪液后剪下2mm放入1.5ml或0.6ml的Eppendorf管底部，加入含有0.2mM底物的100μl酶反应溶液，使酚红棉线完全被淹没，37℃反应1-2h，将反应液转移到96孔平板(使用底部平且透明，孔壁黑色的平板)，使用荧光定量测定仪在激发光393nm、发射光480nm的波长下测定反应液的荧光强度。在以上进行酶学反应的同时需要设定平行的空白对照。空白反应管中除去不含泪液样本外其它所有成分与以上样本管相同。另取吸取同一来源泪液的酚红棉线样品2mm采用上述相同的方法，不同之处在于在加入底物之前先将2μl(1mM)组织蛋白酶S抑制剂Z-FL-COCHO加入到98μl酶反应溶液中，混匀，然后加入10mM的实施例1所述底物至其终浓度为0.2mM，相同的反应条件下反应，将反应液转移到96孔平板，在相同的波长下测定反应液的荧光强度是否与空白对照相似或接近。若与空白相同，说明上述不加抑制剂测得的荧光强度全部由样品中组织蛋白酶S的作用所产生，将该荧光强度根据标准曲线计算即可得出样品中组织蛋白酶S的活性0。采用本实施例2试剂盒，加入抑制剂后测得荧光强度均与空白对照相似，也从另一个角度说明本专利技术的底物对组织蛋白酶S具有高度的特异性。吸取泪液的酚红棉线可立即进行测定，或放入1.5ml的冷冻管中，在-80℃下冻存，一周内进行检测酶活性均无明显变化。试验例11、特异性试验(1)取分别含有等量组织蛋白酶B、H、K、L、S的标准样品，按照实施例2的方法进行酶活测定。组织蛋白酶B、H、K、L、S标准品可从美国公司BioVision购买。实验显示，仅含有组织蛋白酶S的样品有蓝色荧光出现，其他样品均不发射荧光。结果说明除酶S外其它几个家族成员基本不识别该底物。(2)取组织蛋白酶S标准样品(记为样品1)，另取含有等量组织蛋白酶S并含有组织蛋白酶B、H、K、L的混合标准样品(记为样品2)，按照实施例2的方法进行酶活测定，结果显示，样品1和样品2的荧光强度基本相同。结果进一步说明除组织蛋白酶S外其它几个家族成员基本不识别该底物，也对组织蛋白酶S没有促进作用。(3)取泪液样本，按照实施例2的方法进行组织蛋白酶S活性抑制测定。组织蛋白酶B、H、K、L的特异性抑制剂可从美国公司BioVision或英国公司Abcam购入。包括5种抑制剂的酶活性测定同时进行。结果显示，仅含有组织蛋白酶S抑制剂的样品不再产生蓝色荧光，而B、H、K、L的抑制剂基本不影响泪液样本产生的荧光强度。此实验说明1)该试剂盒所用底物高度特异，不被其它几个家族成员所催化形成产物或/和2)泪液中基本不存在其它以上几种家族本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组织蛋白酶S的特异性底物，其结构如下式所示：

【技术特征摘要】
1.一种组织蛋白酶S的特异性底物，其结构如下式所示：2.权利要求1所述的底物在制备干燥综合征诊断试剂盒中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述底物浓度为10mM。4.一种干燥综合征诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的底物，还包括酶反应溶液、组织蛋白酶S抑制剂、产物标准品和眼泪样品采集器。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述酶反应溶液中包括：50mM磷酸钾缓冲液，50mMNaCl，2mMEDTA，0.01wt％Triton0....

【专利技术属性】
技术研发人员：吴永峰，
申请(专利权)人：吴永峰，
类型：发明
国别省市：河北,13