结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用，通过以Cry1Da蛋白为靶分子，投入噬菌体随机展示肽库，通过独特的负筛、缓冲液、包被时间、竞争物洗脱等亲和淘选条件，获得了一种可特异性结合Cry1Da蛋白的多肽分子，其氨基酸序列为：PTAVGGS。本发明专利技术所提及的多肽分子可替代传统的Cry1Da抗体分子，作为Cry1Da的结合分子直接应用于免疫学检测分析，该多肽分子特异性强、结合性能高、结构稳定性、耐酸碱，制备简单快速等特点。

Polypeptide Molecule Binding Cry1Da Protein and Its Application

【技术实现步骤摘要】
结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)蛋白是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌所分泌的一种伴孢晶体内含物，对各类的靶昆虫具有杀虫活性，被称为杀虫晶体蛋白(ICP，InsecticidalCrystalProtein)，又称为δ-内毒素或Bt毒蛋白，是目前市面上Bt杀虫剂的主要成分。它以原毒素形式被目标昆虫摄入后，在昆虫中肠碱性环境中被特异蛋白酶水解，生成能耐受蛋白酶作用的蛋白。激活后的蛋白首先与中肠细胞膜上的特异性受体结合，然后插入到细胞膜中，形成溶解性孔洞，造成细胞释放其内含物，最终导致昆虫死亡。另外，Bt蛋白的抗虫转基因作物也已经推广至全球并取得很好的杀虫效果。Bt蛋白的种类有很多种，根据编码蛋白的杀虫谱和编码基因序列的同源性，可将Bt蛋白分为两大类：分别是晶体蛋白家族(Crystalprotein，Cry)和细胞溶解蛋白家族(Cytolyticprotein，Cyt)。其中的Cry基因又被分为4个类群，即Cry1、Cry2、Cry3、Cry4；根据氨基酸的同源性大小，在Cry1基因的基础上进一步分类为：Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D。伴随转基因作物的全球化，人们开始对转基因作物的安全性产生顾虑，而作为杀虫剂市场占有率最高的Bt蛋白，是否对人类存在威胁也越来越受到世界各国的关注。因此，对转基因食品中Bt蛋白的检测具有重要意义。目前对于Bt蛋白的检测主要依靠免疫学分析，其中以酶联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)尤其是双抗夹心ELISA最为常见。在双抗夹心ELISA中，抗原经过两种抗体(捕获抗体和检测抗体)的特异性选择，使这种方法的特异性和灵敏度都非常高。免疫学分析方法的核心在于抗原-抗体间的特异性识别及结合，因此制备特异性结合抗原的抗体就成为发展免疫学分析方法的前提与核心。抗体的研究近年来发展迅猛，已经从传统的多克隆、单克隆抗体，发展至以单链抗体、噬菌体展示抗体、单域重链抗体、抗独特型抗体等为代表的基因工程抗体领域。相比于传统抗体制备必须经历动物免疫、细胞融合、阳性克隆筛选等复杂程序，基因工程抗体以其可定向改造、淘选方便等优点已成为目前研究的热点。除此以外，近年来包括我国在内的众多学者已经开始着眼于不以免疫球蛋白为主体组成结构的新型抗体研究，例如基于SELEX技术的核酸适配体、基于分子印迹聚合体技术的人工抗体以及基于Lipocalin蛋白家族的抗体类似物等都取得了可喜的进展，为传统抗体的替代性研究提供了扎实的理论和方法学基础。纵观抗体的发展动态，可以看出新型抗体具有分子量小、结构简单、可自我进化、制备快捷的特点及发展趋势。例如，单克隆抗体、单链抗体、单域重链抗体的分子量逐渐减少，分别为150、30-50、15-20kDa，以Lipocalin为骨架蛋白的抗体类似物为18-20kDa，而核酸适配体则仅为一小段核酸序列。近年来人们热衷于研究发展肽模拟物，目的之一是将具有生物活性的复杂分子逐步修饰、取代、改造、最终压缩至仅包含功能单位的小分子，称之为肽模拟物的合理设计。因此，多肽分子可成为潜在的新型抗体分子。随着噬菌体展示多肽库技术的迅速发展，通过噬菌体展示肽库的淘选，无需动物免疫过程即可快速、简单地获得与特定靶体分子特异性结合的多肽分子。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。本专利技术通过噬菌体展示多肽库技术，采用独特的亲和淘选方式，从噬菌体展示多肽库中快速筛选到能与Cry1Da蛋白特异性结合的多肽分子，该多肽分子具有与传统的Cry1Da多克隆、单克隆抗体分子相似的免疫学检测特性，可作为传统Cry1Da抗体的替代物应用于Cry1Da的免疫学分析体系。该方法避免了制备传统的单克隆抗体分子所需要的动物免疫、细胞融合、单克隆筛选等流程，具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是一种结合Cry1Da蛋白的多肽分子及其应用为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术以Cry1Da蛋白为靶分子，投入噬菌体随机展示肽库，通过独特的负筛、缓冲液、包被时间、竞争物洗脱等亲和淘选条件，获得了一种可特异性结合Cry1Da蛋白的多肽分子，其氨基酸序列为：PTAVGGS。上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即S代表丝氨酸残基，P代表脯氨酸残基，H代表组氨酸残基，G代表甘氨酸残基，T代表苏氨酸残基，V代表缬氨酸残基，A代表丙氨酸残基。本专利技术还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列(PTAVGGS)的核苷酸，其序列为：CCTACTGCTTATGGTGGTTCT本专利技术提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。本专利技术还涉及所述多肽分子在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所提及的多肽分子可替代传统的Cry1Da抗体分子，作为Cry1Da的结合分子直接应用于免疫学检测分析，该多肽分子特异性强、结合性能高、结构稳定性、耐酸碱，制备简单快速等特点。具体实施方式实施例1.与Cry1Da蛋白特异性结合多肽分子的亲和淘选及其鉴定1)亲和淘选与Cry1Da蛋白特异性结合多肽分子的具体方法为：将酶标板放在超净工作台紫外照射杀菌半小时后，将2μg/mLCry1Da蛋白包被于酶标板孔(100μL/孔)，用灭菌的饭盒密封保存在4℃冰箱过夜。从4℃取出，在超净台中用PBST(10mMPBS，pH7.4，包含0.8％Tween-20(v/v))洗涤8次，于灭菌吸水纸上拍干；加入5％明胶封闭液37℃孵育5小时。为获得特异性结合Cry1Da的多肽分子，减少非特异性结合，本专利技术在进行亲和淘选之前，将噬菌体随机展示多肽库(噬菌体展示七肽库，购自NEB公司，用PBS稀释噬菌体扩增液，约4.0×1011pfu)分别投入包被有BSA蛋白(10μg/mL)、OVA蛋白(10μg/mL)、脱脂牛奶(10μg/mL)的酶标板孔中进行负筛，收集孔中上清液待用。取包被有Cry1Da蛋白的酶标板孔，用PBST洗涤4次，每孔加入100μL经过上述负筛的孔上清，37℃振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，结合上的噬菌体用抗Cry1Da单克隆抗体进行竞争性洗脱8min，后用1MTris-HCl(pH9.0)中和。取10μL洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.结合Cry1Da蛋白的多肽分子，其特征在于其氨基酸序列为：PTAVGGS。

【技术特征摘要】
1.结合Cry1Da蛋白的多肽分子，其特征在于其氨基酸序列为：PTAVGGS。2.编码权利要求1所述多肽分子氨基酸序列的核苷酸。3.如权利要求2所述的核苷酸序列对应为：CCTACTGCTTATGGTGGTTCT。4.如权利要求1所述多肽分子制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有可特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆华，游凯豪，危泰龙，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36