脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法技术

本发明专利技术提供一种在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型及其的制备方法，将幼龄动物进行单侧颈总动脉结扎术后，进行缺氧2h～3.5h后，送回母鼠身边，饲养3w～5w，存活的动物的腹腔内注射匹罗卡品诱发出Racine标准四级及四级以上癫痫，获得在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型。本发明专利技术的动物模型，其建立方法简单，动物模型的存活率高，存活率为70％以上，模型动物存在学习及长期记忆功能的损害，但短期记忆无损伤，脑电图除可发现无临床发作的电发作即脑电波的异常外，还有可有临床发作的癫痫发作，可广泛应用于不同治疗方法对合并颞叶癫痫的脑瘫患儿的疗效评价，尤其可用于存在认知损害的脑瘫合并颞叶癫痫患儿疗效评估。

Establishment of animal model of temporal lobe epilepsy based on cerebral palsy

【技术实现步骤摘要】
脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法
本专利技术属于神经系统疾病的研究领域，特别涉及一种合并颞叶癫痫的脑瘫疾病模型的造模方法。
技术介绍
脑性瘫痪，是指先天或围生期由多种不同原因造成的中枢神经系统损害，以非进行性的运动障碍为主的一组疾病，主要表现为中枢性运动障碍、肌张力异常、姿势及反射异常，并可同时伴有癫痫，智力低下，语言障碍，视觉及听觉障碍等合并症。本病的发病率较高，国际上脑瘫的发病率为1‰-5‰，我国脑瘫患儿的发病率为1.8‰-4‰，脑瘫的临床表现多种多样，根据运动功能障碍的范围和性质可分为痉挛性、手足徐动型、强直型、共济失调型、震颤型、肌张力低下型和混合型，多采用大鼠幼鼠缺血缺氧方法复制脑瘫疾病，这种动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究。脑瘫的发生发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨脑瘫的发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与脑瘫进行比较研究，有助于有效地认识脑瘫的发生发展规律及研究防治措施。但大鼠幼鼠缺血缺氧的脑瘫模型仅能复制出部分和人相似的临床表现，更无法复制出脑瘫相关的合并症，如癫痫。癫痫发作不仅可引起脑部神经元的坏死或病理性凋亡及神经生物改变，而且，还常常引起患者及家属严重的心理障碍。癫痫患者经常具有羞耻感、不合群、活动受限，保护过度或孤独感是临床上最为常见的社会心理问题。脑瘫患儿主要为运动功能的损害，部分患儿也存在认知功能障碍，脑瘫患儿易继发癫痫的发生，癫痫的发生会进一步加重脑部的损伤和认知功能障碍的恶化，而脑瘫患儿继发癫痫的类型并没有统一的说法，在查阅资料的过程中发现，部分性发作及全身强直阵挛发作均占很高的比例(>50％)。目前还没有相关合并癫痫的脑瘫动物模型供于使用，故对进一步了解具有合并癫痫的脑瘫疾病的发生发展过程以及防治治疗方法均非常不利。
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种新的既有颞叶癫痫又有脑瘫的动物模型。本专利技术能够在现代生物医学研究中得到广泛应用，有助于有效地认识人类疾病的发生、发展规律和研究防治措施。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的一方面，提供一种在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，包括以下步骤：(1)将幼龄动物进行单侧颈总动脉结扎术后，进行缺氧2h～3.5h，获得存活的第一动物；(2)将第一动物送回母鼠身边，饲养3w～5w，获得存活的第二动物；(3)第二动物的腹腔内注射匹罗卡品诱发出Racine标准四级及四级以上癫痫，获得存活的第三动物；(4)对于连续发作1h～1.5h的Racine标准四级及四级以上癫痫的第三动物，终止癫痫发作，得到脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型。在上述技术方案中，所述第一动物为缺血缺氧脑瘫动物模型，即，先进行缺血手术，再进行缺氧操作而获得。所述缺血手术可采用本领域常规手段，优选地，可采用单侧颈总动脉结扎术，单侧颈总动脉结扎后将动物放入37℃保温箱中休息1～3h，再进行缺氧操作，缺氧时间优选为2～3.5小时，更优选为2h。在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述的幼龄动物为7日龄动物。在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述缺氧条件为37±0.5℃、O2含量为8％±0.5。在上述技术方案中，在所述步骤(3)中，匹罗卡品的注射量为10mg/kg～60mg/kg。在上述技术方案中，在所述步骤(3)中，第二动物的腹腔内注射匹罗卡品之前进行如下前处理：注射匹罗卡品18-24h之前，对于第二动物进行腹腔注射氯化锂127mg/kg，放回饲养室饲养，在注射匹罗卡品30min之前，对于放回饲养室饲养的第二动物腹腔注射东莨菪碱10mg/kg。腹腔注射氯化锂，可增强第二动物对匹罗卡品的敏感性，即提高10-60mg/kg匹罗卡品诱发的癫痫发作率。腹腔注射东莨菪碱，可减少呼吸道分泌物的产生，能够降低因呼吸道分泌阻塞呼吸道的死亡率。在上述技术方案中，在所述步骤(3)中，注射匹罗卡品诱发出癫痫Racine标准四级及四级以上的方法包括如下步骤：a)第二动物的腹腔内注射匹罗卡品10mg/kg诱发癫痫，注射匹罗卡品30min后成功诱发出Racine标准四级或四级以上癫痫的、存活的动物作为第三动物；b)在步骤a)中，对于注射匹罗卡品30min后未成功诱发出Racine标准四级或四级以上癫痫的、存活的动物，再次腹腔注射匹罗卡品10mg/kg；c)对于在步骤b)中，注射匹罗卡品30min后未成功诱发出Racine标准四级或四级以上癫痫的动物，反复步骤b)，直至成功诱发出Racine标准四级及四级以上的癫痫，其中，所述反复次数小于6次。在上述技术方案中，在步骤(4)中，所述终止癫痫发作，包括如下步骤：将连续发作1h的Racine标准四级或四级以上癫痫的第三动物，腹腔注射10％水合氯醛(350mg/kg)进行终止发作，发作终止后腹腔注射5％葡萄糖生理盐水，在饲养的前3天，每4h进行腹腔或皮下注射一次5％葡萄糖生理盐水。腹腔或皮下注射葡萄糖生理盐水来给动物补充能量，能够降低动物模型死亡率。本专利技术所建立的动物模型是由脑瘫模型的基础上，继发匹罗卡品颞叶癫痫而构成的，包括脑瘫模型和匹罗卡品颞叶癫痫模型。本专利技术通过调整脑瘫模型的造模时间及缺氧持续时间、颞叶癫痫模型中动物的年龄、性别、造模时机、匹罗卡品的给予浓度以及成功诱发后的颞叶癫痫发作持续时间等，在保证所建立的动物模型成功构建前提下，成功降低了动物模型的死忙率，以提高本专利技术模型建立方法的可实施性。本专利技术的有益效果：1、本专利技术首次提供一种脑瘫后继发颞叶癫痫的动物模型，该模型能够很好地模拟伴发颞叶癫痫的脑瘫，可广泛应用于不同治疗方法对合并颞叶癫痫的脑瘫患儿的疗效评价，尤其可用于存在认知损害的脑瘫合并颞叶癫痫患儿疗效评估。2、本专利技术的脑瘫后继发颞叶癫痫的动物模型，其建立方法简单，动物模型的存活率高，存活率为70％以上。3、本专利技术的脑瘫后继发颞叶癫痫的模型鼠，不仅成功模拟了临床癫痫发作，还成功模拟了仅具备脑电异常的电发作。附图说明图1表示实验鼠Racine四级发作侧面和正面观；图2表示脑瘫后颞叶癫痫造模前缺血缺氧组和假手术组鼠的体重比较结果；图3表示幼鼠组和成年鼠组的癫痫鼠四级出现时间及匹罗卡品用量的比较结果；图4表示脑瘫后癫痫、假手术后癫痫、脑瘫后非癫痫和假手术后非癫痫组学习能力的比较结果；图5表示脑瘫后癫痫、假手术后癫痫、脑瘫后非癫痫和假手术后非癫痫组平台接近时间及目标象限持续时间的比较结果；图6表示脑瘫后癫痫、假手术后癫痫、脑瘫后非癫痫和假手术后非癫痫组头部接触时间及头部接触时间百分比的比较结果；图7表示脑瘫后癫痫、假手术后非癫痫、假手术后癫痫和脑瘫后非癫痫的脑电图结果。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术加以详细说明，借以阐述本动物模型的制作方法，但并不因此而限制本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。实施例1缺血缺氧脑瘫模型的设计与制作1)7日龄SD大鼠幼鼠(体重18-24g)在10％水合氯醛(约350本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将幼龄动物进行单侧颈总动脉结扎术后，进行缺氧2h～3.5h，获得存活的第一动物；(2)将第一动物送回母鼠身边，饲养3w～5w，获得存活的第二动物；(3)第二动物的腹腔内注射匹罗卡品诱发出Racine标准四级及四级以上癫痫，获得存活的第三动物；(4)对于连续发作1h～1.5h的Racine标准四级及四级以上癫痫的第三动物，终止癫痫发作，得在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将幼龄动物进行单侧颈总动脉结扎术后，进行缺氧2h～3.5h，获得存活的第一动物；(2)将第一动物送回母鼠身边，饲养3w～5w，获得存活的第二动物；(3)第二动物的腹腔内注射匹罗卡品诱发出Racine标准四级及四级以上癫痫，获得存活的第三动物；(4)对于连续发作1h～1.5h的Racine标准四级及四级以上癫痫的第三动物，终止癫痫发作，得在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型。2.根据权利要求1所述的在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的幼龄动物为7日龄动物。3.根据权利要求1所述的在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述缺氧条件为37±0.5℃、O2含量为8％±0.5。4.根据权利要求1所述的在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，匹罗卡品的注射量为10mg/kg～60mg/kg。5.根据权利要求1所述的在脑瘫基础上的颞叶癫痫动物模型的建立方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，第二动物的腹腔内注射匹罗卡品之前进行如下前处理：注射匹罗卡品18-24h之前，对于第二动物进行腹腔注射氯化锂127mg/kg...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，张宏云，邹伟，马静云，
申请(专利权)人：大连医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21