用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种禽白血病的荧光偏振免疫分析检测试剂盒，其包括禽白血病阳性对照、禽白血病阴性对照、荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液、样本稀释液、反应微孔板组成。利用该试剂盒，该试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒。本发明专利技术提供的检测试剂盒与传统技术相比较，优势明显，技术改进明显，特别是针对禽白血病净化形式复杂、需求旺盛，具有非常广阔的市场前景，可在基层检测和政府监管中发挥重大作用。

Fluorescence polarization immunoassay kit and method for detection of avian leukemia virus

【技术实现步骤摘要】
用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法
本专利技术属于生物检测技术制备领域，具体涉及一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法。
技术介绍
禽白血病(AvianLeukosisDisease)是由禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus，ALV)引起的病毒性传染病，是由禽C型反转录病毒群的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称，主要是淋巴细胞性白血病，其次是成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病。此外，还可引起骨髓细胞瘤、结缔组织瘤、上皮肿瘤、内皮肿瘤等。大多数肿瘤侵害造血系统，少数侵害其他组织。禽白血病病毒ALV属于反转录病毒科α反转录病毒属。根据其囊膜蛋白的抗原性，迄今为止已将ALV分为A-J十个亚群。ALV主要引起鸡群感染、发病，既可引起免疫抑制、生产性能下降等亚临床致病作用，还能诱发各种急性或慢性的不同细胞类型的肿瘤。随流行毒株变异及鸡群遗传背景的不同而表现出诸如纤维肉瘤、淋巴肉瘤、成红细胞瘤、髓细胞样肿瘤、组织细胞瘤、骨硬化症等不同肿瘤。禽白血病呈世界性分布，并且可垂直传播，严重制约着养禽业的发展。目前该病尚无切实可行的治疗方法，也无有效的疫苗，唯一有效的控制方法是净化。ALV传播方式有垂直传播和水平传播，传染源是病鸡和带毒鸡。有病毒血症的母鸡，其整个生殖系统都有病毒繁殖，以输卵管的病毒浓度最高，特别是蛋白分泌部，因此其产出的鸡蛋常带毒，孵出的雏鸡也带毒。这种先天性感染的雏鸡常有免疫耐受现象，它不产生抗肿瘤病毒抗体，长期带毒排毒，成为重要传染源。为了从根源上控制禽白血病，不同的种鸡场和原种鸡场都根据自身特点制定了切实可行的净化方案。这些净化方案的核心关键就是要多次检测、剔除阳性鸡，确保种群的干净和纯粹。而目前检测携带有禽白血病病毒的主要方法有酶联免疫法(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)等，其中ELISA方法主要以ALV保守基因p27表达的P27蛋白为检测目标，通过检测P27蛋白判断鸡是否感染ALV。因使用方便，可批量检测，ALV的ELISA方法在实际检测中有大量应用，国内外也有商品化产品，如美国IDEXX、荷兰BioChek以及美国Affinitech等。此外，国内也有一些禽白血病抗原ELISA检测相关专利，如申请号为201310161174.1的专利技术专利“一种用于检测禽白血病P27的酶联免疫反应载体及试剂盒”公布的禽白血病ELISA检测方法，采用多克隆抗体包板，酶标单抗检测，孵育时间为1小时45分钟，最后通过酶标仪检测；申请号为201210113675.8的专利技术专利“检测禽白血病群检测禽白血病特异性抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒”公开的是间接双抗体夹心ELISA，其采用单抗包板，多抗夹心，二抗检测，整体耗时为2小时20分钟；陈晨等2005年在《禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化》(中国预防兽医学报,2005,27(6):535-539)公开的ELISA方法则与美国IDEXX公司的产品类似，整体反应时间也超过1小时。通过以上对比可知，现有ELISA技术的主要缺陷在于检测时间长，操作较为复杂，且需要酶标仪，只能在化验室或者中心实验室具有酶标仪才能开展检测，无法在基层养殖场大规模推广应用。PCR方法与ELISA方法相比较，其缺陷更为明显，操作繁琐复杂，精密度还要求高，PCR仪器动辄数万元，RT-PCR更是达数十万元，且操作人员需要专业水平，否则易出现假阳性或假阴性结果，基层企业难以承担。因此，亟需开发出便捷、操作简单、灵敏度高的检测方法和产品
技术实现思路
为了解决上述技术操作复杂繁琐、耗时长的缺陷问题，本专利技术提供一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒及方法，采用试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒，其包括荧光素标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液、样本处理液、阳性对照、阴性对照和反应微孔板，其中，所述阳性对照为灭活的禽白血病病毒JS09株，所述阴性对照为未接病毒的细胞培养上清，所述样本处理液是含禽白血病病毒特异性单克隆抗体的PBST溶液。如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、戊二胺罗丹明、4’-氨甲基荧光素等。进一步地，荧光素的浓度为0.01～1mg/mL，标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液为0.1～5mg/mL所用的稀释液是pH值为7.4、浓度为0.01mol/L的PBS。所述反应微孔板为不透明的塑料96孔板。如上所述的试剂盒，优选地，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为0.5～5μg/ml，PBST溶液为含体积比为0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。进一步地，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为1～2.5μg/mL。如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光素标记优选为异硫氰酸荧光素(FITC)，浓度为0.5～1.0mg/mL。如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为多个，是具有梯度滴度的禽白血病病毒。此时，可以根据检测结果绘制校准曲线，对样本中的禽白血病病毒定量检测。如上所述的试剂盒，优选地，所述阳性对照为106TCID50、105TCID50、104TCID50、103TCID50或102TCID50的禽白血病病毒JS09株。一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析方法，其采用如上所述的试剂盒进行检测，其包括如下步骤：S1、采集泄殖腔拭子或胎粪或蛋清样本；S2、泄殖腔拭子或胎粪样品或蛋清样本加入到样本稀释液中，振荡作为样本溶液；S3、用移液器吸取处理好的样本溶液加入反应微孔中，然后继续加入荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液、样本处理液，室温孵育10min；同时做阳性对照和阴性对照，也就是阳性对照和阴性对照直接加入反应微孔中进行检测；所述阴性对照为采用未接种病毒的DF1细胞上清进行检测；所述阳性对照为含禽白血病病毒JS09株的溶液进行检测；S4、利用荧光偏振免疫分析仪读取荧光偏振信号，根据阴性对照与样本检测的荧光偏振值之差即ΔFP值确定样本检测结果，样本中病毒含量与荧光偏振值呈负相关关系。如上所述的分析方法，优选地，在步骤S3中，所述样本溶液加入量为100μL，所述荧光素标记的禽白血病重组P27蛋白溶液为50μL，所述样本处理液50μL。如上所述的分析方法，优选地，在步骤S4中，ΔFP值大于或等于20mP时判为阳性，ΔFP值小于20mP时判定为阴性。如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，泄殖腔拭子或胎粪样品检测时无需稀释，蛋清样品在96孔血清稀释板中按1:1的比例用样本稀释液进行稀释。需要注意的是，样品若不立即使用或进行检测，可在短时间内(1～4小时)应置于4℃保存，长时间(≥4小时)需置于-20℃保存。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析检测试剂盒操作简便、无需特殊培训即可进行检测操作，检测灵敏度高，非常适合禽白血病大规模、快速检测。与传统的病原学分析方法和常规ELISA方法相比，本专利技术具有以下优点：1)检测耗时短，效率高。该试剂盒可在15分钟内检测出鸡是否感染禽白血病病毒，利用96孔微孔板可同时检测至少46份样本(以双孔重复对照计算)，检测效率高。2)检测灵敏度高，成本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒，其特征在于，其包括荧光素标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液、样本处理液、阳性对照、阴性对照和反应微孔板，其中，所述阳性对照为灭活的禽白血病病毒JS09株，所述阴性对照为未接病毒的细胞培养上清，所述样本处理液是含禽白血病病毒特异性单克隆抗体的PBST溶液。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析试剂盒，其特征在于，其包括荧光素标记的禽白血病毒重组P27蛋白溶液、样本处理液、阳性对照、阴性对照和反应微孔板，其中，所述阳性对照为灭活的禽白血病病毒JS09株，所述阴性对照为未接病毒的细胞培养上清，所述样本处理液是含禽白血病病毒特异性单克隆抗体的PBST溶液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为异硫氰酸荧光素、戊二胺罗丹明或4’-氨甲基荧光素。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述禽白血病病毒特异性单克隆抗体的浓度为0.5～5μg/mL，PBST溶液为含体积比为0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素标记优选为异硫氰酸荧光素，浓度为0.5～1.0mg/mL。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为多个，是具有梯度滴度的禽白血病病毒。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为104TCID50含禽白血病病毒JS09株的溶液。7.一种用于检测禽白血病毒的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于，其采用如权利要求1-6中任一项所述的试剂盒进...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯小宇，杨春江，梅力，赵荣茂，韦海涛，宋彦军，莫勋，魏单平，高晓龙，陈会玲，吴佳兴，罗伏兵，
申请(专利权)人：北京市动物疫病预防控制中心，北京纳百生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11