一种促进青蒿酸积累的方法技术

本发明专利技术提供了一种促进青蒿酸积累的方法，其通过向培养基中添加外援调控因子和较为便宜易得的植物油脂，并在可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸，并对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控，从而在确保酿酒酵母工程菌中质粒稳定性的基础上，极大地促进了青蒿酸的积累，使青蒿酸发酵产量最高可以提高50％以上，且发酵周期也有效缩短，效果显著。本发明专利技术所提供的技术方案简单易行，进一步提高了青蒿酸的生产效率，易于青蒿酸的工业化生产应用。

A Method to Promote Accumulation of Artemisinic Acid

【技术实现步骤摘要】
一种促进青蒿酸积累的方法
本专利技术涉及工业微生物发酵
，具体涉及一种促进青蒿酸积累的方法。
技术介绍
青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，分子式为C15H22O5，由中国药学家屠呦呦在1971年发现。青蒿素是继乙氨嘧啶、氯喹、伯喹之后最有效的抗疟特效药，尤其是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾，具有速效和低毒的特点，曾被世界卫生组织称做是“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”。其抗疟疾作用机理主要在于在治疗疟疾的过程通过青蒿素活化产生自由基，自由基与疟原蛋白结合，作用于疟原虫的膜系结构，使其泡膜、核膜以及质膜均遭到破坏，线粒体肿胀，内外膜脱落，从而对疟原虫的细胞结构及其功能造成破坏。青蒿素自发现至今的近50年中，在治疗疟疾等相关疾病领域得以广泛使用，近些年，随着各国科学家的持续研究发现，青篙素在抗血吸虫、调节或抑制体液的免疫功能、提高淋巴细胞的转化率，利胆，祛痰，镇咳，平喘等其他疾病的治疗中也显示出诱人的前景，同时，据统计数据显示，每年全世界对于青蒿素及其衍生物的销售额便多达数十亿美元，因此，青蒿素市场前景非常广阔。目前，青蒿素可通过三种方法获得，一种是传统的从青蒿植物中提取获得，该方法受到气候、地域的影响大，产量不稳定，导致青蒿素原料价格逐年波动较大；二是通过化学全合成获得，此方法难度极大，反应过程复杂，反应条件苛刻，同时，反应成本高昂；第三种方法是通过基因工程技术，借助微生物发酵培养获得青蒿酸，再将发酵获得的青蒿酸经化学合成，最终获得青蒿素，该生物发酵加化学半合成的方法与植物提取和化学全合成相比较而言，具有反应条件温和，产量高，生产稳定，易于工业化生产等优点。鉴于上述优点，通过微生物发酵的方法得到青蒿酸，然后经过化学合成生产青蒿素的方法已被广泛接受并得到推广应用，2013年，WHO也批准通过了该工艺生产的青蒿素应用于临床。微生物发酵加化学半合成制备青蒿素的方法中，青蒿酸的发酵成本、工艺可行性及发酵产量等因素是青蒿素能否高效、低成本获得的关键影响因素。青蒿酸的微生物发酵方法开发始于2004年盖茨基金会的支持项目，国内外所采用的技术均是以此为基础发展而来。现目前，通过基因工程手段构建的可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌在发酵过程中，仍然存在发酵成本偏高、发酵生产过程中用到大量有机溶剂等有毒有害物质，且发酵周期较长等问题，最终导致生物合成青蒿素的成本仍然无法与通过植物提取方法获得的青蒿素相抗衡而导致生物加化学半合成方法获得的青蒿素最终未能形成大规模的产业化生产与应用。文章High-levelsemi-syntheticproductionofthepotentantimalarialartemisinin(CJPaddon，PJWestfall，DJPitera,et.al.Nature,2013,496(7446):528-532)中采用有机溶剂肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的大量添加，不利于成本的控制，且菌种遗传稳定性差，产量不稳定，发酵周期较长，不利于工业化大规模生产。文章Productionofamorphadieneinyeast,anditsconversiontodihydroartemisinicacid,precursortotheantimalarialagentartemisinin(PJWestfall,DJPitera,JRLenihan,et.al.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.2012,109(3):E111-E118)中描述一种通过对酿酒酵母工程菌基因改造的方式，实现紫穗槐-4,11-二烯的高产，最高产量可达40g/L，但是，从紫穗槐-4,11-二烯到青蒿酸，再到青蒿素，中间依然需要多步化学合成，且收率较低，因此，其实际工业化应用较差。专利CN101338309A公开了一种通过将GYP71AV1P450基因和P450还原酶CPR基因导入酿酒酵母细胞来获得青蒿酸基因工程菌从而生产青蒿酸的方法，该方法对青蒿酸发酵产量的工艺优化及产量描述较少；专利CN105316372A公开了一种发酵生产青蒿酸的方法，其通过向发酵液中大量添加正己烷、正庚烷、甲苯、二甲苯或间二甲苯等有机溶剂，实现发酵液中青蒿酸的萃取，从而提高青蒿酸的产量，但是，该技术中所用的正己烷或正庚烷等有机试剂具有沸点低，易挥发的缺点，甲苯或二甲苯等有机试剂则有强烈的致癌性，因此，实际发酵生产可操作性差，且不符合环境友好型和可持续性发展的理念。我公司在为了克服青蒿酸发酵技术中存在的菌种性状不稳定而导致批次间发酵产量波动较大，发酵过程中半乳糖和有机溶剂的大量添加导致青蒿酸发酵成本居高不下、且由于大量有机溶剂的使用也不利于环境保护，难以实现清洁绿色可持续化生产等缺点，因此，我们开发了一种提高青蒿酸发酵产量的方法，具体公开在CN108611383A,该方法具备菌种遗传稳定性高、彻底摒弃了有毒有害有机溶剂的使用、通过乳糖水解有效降低了发酵成本、且发酵产量提高明显等优势，但该技术仍然存在发酵周期较长、乳糖水解工艺复杂、培养基中依旧添加有机溶剂、发酵成本依然较高等问题。
技术实现思路
针对青蒿酸发酵现有技术中存在的发酵工艺复杂、生产成本高、发酵周期长，以及发酵过程中添加有机溶剂等缺点，本专利技术提供了一种促进青蒿酸积累的方法。一种促进青蒿酸积累的方法，包括以下步骤：1)在发酵开始前，向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加外援调控因子和植物油脂；2)在酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸；3)在酿酒酵母工程菌的整个发酵培养过程中，对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控。在优选的实施方案中，所述向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的外援调控因子为异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸的一种或几种，所述外援调控因子的添加使其在发酵培养基的浓度为0.5-5g/L。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的植物油脂为豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油的一种或几种，更优选的，所述植物油脂的添加体积为发酵培养基初始体积的5-35％。在优选的实施方案中，所述植物油脂的添加时间为发酵开始前加入，添加方式为一次性添加。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的镁盐为硝酸镁、硫酸镁中的一种或两种，更优选的，所述镁盐的添加时间为发酵的第30-45h，所述镁盐的添加使其在发酵培养基中的浓度为2-10g/L。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的氨基酸为缬氨酸，更优选的，所述氨基酸的添加时间为发酵的第30-45h，所述氨基酸的添加使其在发酵培养基中的浓度为0.2-5g/L。在优选的实施方案中，所述发酵过程中温度的调控为：发酵开始时，发酵温度为28-32℃，发酵第40-55h后，发酵温度降至22-25℃，直至发酵结束。在优选的实施方案中，所述发酵过程中溶氧的调控为：发酵开始时，发酵溶氧为30-50％，发酵第40-55h后，发酵溶氧降至10-20％，直至发酵结束。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌发酵周期为65-75h。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母工程菌的发酵培养基为：葡萄糖15-30g/L；半乳糖2-10g/L；硫酸铵8-15g/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于：1)在发酵开始前，向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加外援调控因子和植物油脂；2)在酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸；3)在酿酒酵母工程菌的整个发酵培养过程中，对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控。

【技术特征摘要】
1.一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于：1)在发酵开始前，向酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加外援调控因子和植物油脂；2)在酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加镁盐和氨基酸；3)在酿酒酵母工程菌的整个发酵培养过程中，对发酵温度及发酵溶氧进行阶段调控。2.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的外援调控因子为异戊酸、异丁酸和2-甲基丁酸的一种或几种，所述外援调控因子添加使其在发酵培养基中的浓度为0.5-5g/L。3.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌发酵培养基中添加的植物油脂为豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油的一种或几种，所述植物油脂的添加体积为发酵培养基初始体积的5-35％。4.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述植物油脂的添加时间为发酵开始前加入，添加方式为一次性添加。5.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的镁盐为硝酸镁和硫酸镁的一种或两种，所述镁盐的添加时间为发酵的第30-45h，所述镁盐的添加使其在发酵培养基中的浓度为2-10g/L；所述酿酒酵母工程菌发酵培养过程中，向培养基中添加的氨基酸为缬氨酸，所述氨基酸的添加时间为发酵的第30-45h，所述氨基酸的添加使其在发酵培养基中的浓度为0.2-5g/L。6.如权利要求1所述的一种促进青蒿酸积累的方法，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌发酵过程中温度的调控为：发酵开始时，发酵温度为28-32℃，发酵第40-55h后，发酵温度降至22-25℃，直至发酵结束；所述酿酒酵母工程菌发酵过程中溶氧的调控为：发酵开始时，发酵溶氧为30-50％，发酵第40-55h后，发酵溶氧降至10-20％，直至发...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，滕云，陈亚军，胡栋，毛亮亮，郑玲辉，徐彬，应雪肖，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33