一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种工艺步骤少、生产成本低、高比活性的高纯人凝血因子IX制剂生产方法。包括以下步骤：(1)血浆冷沉淀去除；(2)DEAE sephadex A50阴离子交换层析；(3)S/D灭活病毒；(4)非Ca

Production of a high purity human coagulation factor IX preparation

【技术实现步骤摘要】
一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法
本专利技术属于生物制药和血液制品
，具体涉及血液制品生产中一种工艺步骤少、生产成本低、高比活性的高纯人凝血因子IX制剂生产方法。
技术介绍
人凝血因子IX(humancoagulationfactorIX,hFIX)是一种具有关键作用的凝血因子，属于维生素K依赖性糖蛋白，是人体内源性凝血级联反应中丝氨酸蛋白酶的前体，在人体内源性凝血途径中发挥着非常重要的作用。乙型血友病是一种罕见的遗传疾病，发病率约为1/25000。乙型血友病的病因在于凝血因子IX的缺失，患者一旦出血后，就需要极长的时间来凝血。一些轻微的受伤，就可能带来足以威胁生命的影响。对于病情严重的患者，他们的关节和肌肉还会经常自发出血，带来痛苦。目前针对这一疾病的主流疗法是使用人凝血酶原复合物(ProthrombinComplexConcentrate，PCC)输注治疗，控制和预防出血事件。但使用PCC治疗乙型血友病或凝血因子IX缺乏症时，由于PCC中含有维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、蛋白S、a-胰蛋白酶抑制剂、高分子量激肽原等，因而大剂量使用PCC可能会引起血栓形成和弥漫性血管内凝血，具有一定的风险。因此，从血浆中分离出高纯度凝血因子IX制品可有效控制患者的出血状况，并且显著降低患者用药过程中血栓发生的风险，具有相当大的市场前景，国内外对高纯凝血因子IX制品的研究热情极高。随着临床医生的逐步认可，高纯凝血因子IX产品的使用量也在逐年增加；目前，我国尚未有血浆来源的高纯凝血因子IX产品上市，加之原料血浆紧张，血浆来源的高纯凝血因子IX产品市场短缺，其生产制备引起了各方面的关注。蔡骏等在《柱层析法制备高纯人血FⅨ研究初探》中报告了一种用DEAESephadexA50，DEAE-SepharoseFF和Heparin-SepharoseCL-6B制备高纯度凝血因子Ⅸ的方法，最终凝血因子Ⅸ成品比活为35±2.0IU/mg，回收率约为30％。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子Ⅸ的层析分离》中采用自制的DEAEBio-SepFF和肝素Bio-Sep介质，经过2步弱阴离子交换和1步亲和层析从去冷沉淀血浆中分离纯化凝血因子Ⅸ，成品比活达到99.40IU/mg，回收率约为30％。上述方法均使用2步阴离子交换和1步肝素亲和层析纯化凝血因子Ⅸ，产品得率尚可，但由于肝素配基填料开发初衷是作为AT-III的吸附剂，该凝胶对于AT-III、凝血因子(包括VII，IX)、脂蛋白、脂酶、蛋白合成因子；激素、类固醇受体、核酸结合酶、限制性内切酶、干扰素等数十种蛋白种类均有吸附作用，对于人凝血因子IX的吸附特异性不强，故以上制备工艺所制备的人凝血因子IX成品比活性均较低，甚至不能满足欧洲药典中要求比活性不低于50IU/mg的最低要求，因此，以上制备工艺均不具备批量生产价值。公开日为2008.10.22，公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲合层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方法，该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性，所制备的人IX凝血因子比活性较高，可达150IU/mg。但由于其生产工艺繁琐，需经过4次层析步骤，本领域专业技术人员公知，每经过1次层析纯化步骤，均不可避免地会造成目标蛋白损失，因此，该制备工艺产品得率较低；此外，4次层析步骤需耗费大量凝胶填料，生产成本极高，不便于大范围推广。综上所述，市场急需一种工艺步骤少，生产成本低，同时比活性更高的高纯凝血因子IX产品制造方法，来最大限度的满足临床病人的需求和最大可能的提高血浆利用率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种工艺步骤少、生产成本低、高比活性的高纯人凝血因子IX制剂生产方法。为实现此目的，本专利技术采用以下技术方案。一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法，其特征在于包含以下步骤：(1)血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液；(2)离子交换凝胶吸附：血浆温度控制在10-15℃，按照1.0-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE-sephadexA-50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌，静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用连续过滤器进行过滤，收集吸附后的A-50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；(3)装柱洗脱：将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为30-40cm/h，冲洗时间约60-90min。洗涤后的A-50凝胶使用洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为30-40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500mAu后停止洗脱，收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤；(4)S/D灭活病毒：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃，灭活6h；(5)亲和层析：将琼脂糖免疫亲和凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡5-10个柱体积，S/D灭活后料液流入层析柱，上样流速为50-80cm/h。上样完成后使用两种不同的洗涤液进行复合洗涤，洗涤液流速为50-80cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为50-80cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于100mAu后停止洗脱，收集洗脱液；(6)配液：向洗脱液中加入保护剂，所述保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物；使用稀释液对洗脱液进行稀释，调节活力为30-40IU/ml，pH7-7.5，使用0.45um滤芯过滤；(7)纳滤膜除病毒过滤；(8)分装，冷冻干燥，得到高纯人凝血因子IX制剂成品。进一步的，所述的步骤(3)中的洗涤液为含20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.1-0.5mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠，pH为6.8-7.0的洗涤缓冲液A；优选为含25mmol/L的柠檬酸钠，0.25mol/L的氯化钠，200IU/ml的肝素钠，pH为6.9的洗涤缓冲液。进一步的，所述步骤(3)中的洗脱液为含20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-1.0mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠，pH为6.8-7.0的洗脱缓冲液A；优选为含25mmol/L的柠檬酸钠，0.8mol/L的氯化钠，200IU/ml的肝素钠，pH为6.9的洗脱缓冲液。进一步的，所述步骤(5)中的亲和层析介质为琼脂糖免疫亲和凝胶；优选使用非Ca2+依赖型IX因子免疫亲和凝胶，凝胶用量为0.5ml/kg血浆。进一步的，所述的步骤(5)中的复合洗涤为使用两种不同的洗涤缓冲液进行3次分步洗涤。第1次洗涤：使用含10-30mmol/L的Tris，0.1-0.15mol/L的氯化钠，pH为6.8-7.5的洗涤缓冲液B洗涤8-12个柱体积；优选为使用含20mmol/L的Tris，0.15mol/L的氯化钠，pH为7.4的洗涤缓冲液B洗涤8个柱体积。第2次洗涤：使用含10-30mmol/L的Tris，0.4-0.6mol/L的氯化钠，0.05-0.1％T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法，其特征在于包含以下步骤：(1)血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液；(2)离子交换凝胶吸附：血浆温度控制在10‑15℃，按照1.0‑1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE‑sephadex A‑50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌，静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用连续过滤器进行过滤，收集吸附后的A‑50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；(3)装柱洗脱：将吸附后的A‑50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为30‑40cm/h，冲洗时间约60‑90min。洗涤后的A‑50凝胶使用洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为30‑40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500mAu后停止洗脱，收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤；(4)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24‑26℃，灭活6h；(5)亲和层析：将琼脂糖免疫亲和凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡5‑10个柱体积，S/D灭活后料液流入层析柱，上样流速为50‑80cm/h。上样完成后使用两种不同的洗涤液进行复合洗涤，洗涤液流速为50‑80cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为50‑80cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于100mAu后停止洗脱，收集洗脱液；(6)配液：向洗脱液中加入保护剂，所述保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物；使用稀释液对洗脱液进行稀释，调节活力为30‑40IU/ml，pH7‑7.5，使用0.45um滤芯过滤；(7)纳滤膜除病毒过滤；(8)分装，冷冻干燥，得到高纯人凝血因子IX制剂成品。...

【技术特征摘要】
1.一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法，其特征在于包含以下步骤：(1)血浆冷沉淀的去除：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，混浆，连续离心等工序去除血浆中的冷沉淀，得到无冷沉淀的血浆离心上清液；(2)离子交换凝胶吸附：血浆温度控制在10-15℃，按照1.0-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的DEAE-sephadexA-50凝胶，搅拌吸附45min后关闭搅拌，静置沉降45min。凝胶吸附后的血浆使用连续过滤器进行过滤，收集吸附后的A-50凝胶，血浆滤过液并入血浆罐；(3)装柱洗脱：将吸附后的A-50凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱泵入洗涤液进行在线冲洗，洗涤液流速为30-40cm/h，冲洗时间约60-90min。洗涤后的A-50凝胶使用洗脱液进行在线洗脱，洗脱液流速为30-40cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于500mAu后停止洗脱，收集洗脱液并使用0.45um滤芯过滤；(4)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入过滤后的洗脱液中，添加完毕后搅拌30min。调整液温为24-26℃，灭活6h；(5)亲和层析：将琼脂糖免疫亲和凝胶装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液平衡5-10个柱体积，S/D灭活后料液流入层析柱，上样流速为50-80cm/h。上样完成后使用两种不同的洗涤液进行复合洗涤，洗涤液流速为50-80cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液进行洗脱，洗脱液流速为50-80cm/h，待在线紫外检测器中的紫外吸收值低于100mAu后停止洗脱，收集洗脱液；(6)配液：向洗脱液中加入保护剂，所述保护剂为盐、糖、氨基酸或其混合物；使用稀释液对洗脱液进行稀释，调节活力为30-40IU/ml，pH7-7.5，使用0.45um滤芯过滤；(7)纳滤膜除病毒过滤；(8)分装，冷冻干燥，得到高纯人凝血因子IX制剂成品。2.根据权利要求1所述的一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法，其特征在于所述的步骤(3)中的洗涤液为含20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.1-0.5mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠，pH为6.8-7.0的洗涤缓冲液A；优选为含25mmol/L的柠檬酸钠，0.25mol/L的氯化钠，200IU/ml的肝素钠，pH为6.9的洗涤缓冲液。所述洗脱液为含20-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-1.0mol/L的氯化钠，200-500IU/ml的肝素钠，pH为6.8-7.0的洗脱缓冲液A；优选为含25mmol/L的柠檬酸钠，0.8mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱光祖，罗观文，胡川，殷如，杨波波，庾昌文，骆燕容，
申请(专利权)人：广东双林生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44