一种聚肌胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种聚肌胞的制备方法，属于生物医药技术领域。首先利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸，胞苷二磷酸制备聚胞苷酸；再利用制备的聚肌苷酸和聚胞苷酸反应获得高纯的聚肌胞产品。本发明专利技术通过自行研制的高纯度聚肌苷酸和聚胞苷酸来制备聚肌胞，使得制备的聚肌胞纯度高，同时降低了制备过程中的处理难度。

A preparation method of polymyocytes

【技术实现步骤摘要】
一种聚肌胞的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种聚肌胞的制备方法。
技术介绍
聚肌苷酸胞苷酸(简称聚肌胞，PIC)是一种安全高效的先天免疫激活剂，具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、增强机体免疫力等多种功能，全球市场容量潜力估值为每年数百亿美元。医学临床上，可用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎等病毒性疾病治疗，对乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的辅助性治疗已处于III期临床实验阶段。兽医临床上，可用于口蹄疫、禽流感、猪瘟等病毒性疫病的预防和治疗，亦可提高畜禽疫苗免疫效力。聚肌胞使用方便、广泛，可以与许多药物同时使用，具有协同或相加作用。无种属特异性，可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用，同时还具有抗病毒谱广，毒性小、安全范围大的优点。在本领域原来聚肌胞的生产大多采用化学合成或采购半成品PI(聚肌苷酸)与PC(聚胞苷酸)，再将PI与PC物理混合的方式进行生产，存在成本高昂，不能规模化生产，生产流程不完整，分子结构不正确，终极产品质量无法保证等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种聚肌胞的制备方法，该专利技术是通过利用肌苷二磷酸制备聚肌苷酸，胞苷二磷酸制备聚胞苷酸；再利用制备的聚肌苷酸和聚胞苷酸反应获得高纯的聚肌胞产品。本专利技术的技术方案如下：一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：(1)分别将聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂加热至37℃；(2)然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；(3)将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为0.5-1.5h；(4)将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品，所述聚肌苷酸精滤液是在肌苷二磷酸(简称IDP)溶液中加入MgCl2，肌苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液；所述聚胞苷酸的精滤液是在胞苷二磷酸(简称CDP)溶液中加入MgCl2，胞苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液。优选的，所述稳定剂为硫酸卡那霉素，聚赖氨酸，葡萄糖酸钙中的一种或几种。优选的，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为0.5-1.5wt％。优选的，所述肌苷二磷酸溶液的制备方法包括以下步骤：1)ATP脱氨制成肌苷三磷酸溶液，将ATP中缓慢加入25-35wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.2-2.0，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止,获得肌苷三磷酸溶液；2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为10-15:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为2-3％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅拌；升温至36-37℃进行酶解，当溶液中肌酐三磷酸占总胞苷重量小于1％，反应即为终止，立即用盐酸调整溶液的pH为2；5)将反应结束后的发酵液冷却至25℃，并加入2％的珍珠岩粉末充分搅拌，待发酵液温度降至20℃以下后过滤、柱层析处理、脱色和超滤后获得肌酐二磷酸溶液。优选的，所述胞苷二磷酸溶液的制备方法包括以下步骤：1)磷酸化，将200～500重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至30～31℃，停止加热，投入2～10重量份氯化镁、20～50重量份磷酸二氢钾、20～50重量份白糖，控制温度在31～33℃反应10～20分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应2-5小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在36～37℃，加入核苷酸降解酶进行降解，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液。在胞苷二磷酸溶液制备过程中，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为0.5-2:1。与现有技术相比，本申请的有益效果如下：本专利技术是通过肌苷二磷酸IDP制备聚肌苷酸PI，胞苷二磷酸CDP制备聚胞苷酸PC；再利用制备的聚肌苷酸PI和聚胞苷酸PC反应获得高纯的聚肌胞PIC产品。在制备PI和PC过程中，通过调整工艺手段，有效除去PI和PC产品中的内毒素、残留DNA及残余宿主菌体蛋白等杂质，在PI和PC聚合过程中降低了生产难度，有利于杂质的除去，利用所制备的PI和PC使得本专利技术制备的PIC为结构稳定的双链核糖核苷酸聚肌胞产品，大大提高了产品纯度和有效成分的含量。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种聚肌胞的制备方法，包括以下步骤：1、制备胞苷二磷酸CDP溶液1)磷酸化，将300重量份酵母投入磷酸化反应罐中搅拌，水浴加热至31℃，停止加热，投入5重量份氯化镁、30重量份磷酸二氢钾、20重量份白糖，控制温度在31℃反应20分钟，然后加入胞苷酸30重量份，反应3小时，当胞苷三磷酸含量大于85％时反应完成，立即调pH至2终止反应，同时用冷冻水进行冷却；2)层析纯化，将步骤1)冷却后磷酸化产物进行板框过滤、层析、吸附、洗涤、洗脱和脱色钠滤；3)降解，将步骤2)层析纯化后的溶液在37℃，加入核苷酸降解酶进行降解，所述核苷酸降解酶的加入量与步骤2)纯化后溶液中磷酸化产物的重量比为1:1，胞苷三磷酸占总胞苷小于3％时反应完成，调pH至2终止反应，同时将反应溶液冷却至20℃以下；4)对步骤3)中冷却后的溶液依次进行板框过滤、吸附、洗涤、洗脱、脱色和超滤纳滤，即获得胞苷二磷酸溶液。2、制备肌酐二磷酸IDP溶液1)将ATP中缓慢加入30wt％亚硝酸钠，反应6个小时后，调整pH至1.2，继续反应40个小时以上，直至不产生浓烟为反应终止，获得肌苷三磷酸溶液；2)肌酐三磷酸溶液脱色处理,将步骤1)制备肌苷三磷酸溶液的pH调整至中性，然后加入活性炭脱色处理，过滤后即制得脱色的肌酐三磷酸溶液；3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；4)降解反应，将步骤2)脱色后的肌酐三磷酸溶液与步骤3)制备的降解酶溶液混合，混合溶液中肌酐三磷酸与降解酶的重量比为13:1，然后加入纯化水，调整溶液中的肌酐三磷酸浓度为2％，并调整溶液的pH为中性；再加入占肌酐三磷酸重量为20％的葡萄糖，充分搅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚肌胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别将聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂加热至37℃；(2)然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；(3)将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为0.5‑1.5h；(4)将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品，所述聚肌苷酸精滤液是在肌苷二磷酸溶液中加入MgCl2，肌苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液；所述聚胞苷酸的精滤液是在胞苷二磷酸溶液中加入MgCl2，胞苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液。

【技术特征摘要】
1.一种聚肌胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别将聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂加热至37℃；(2)然后将加热后的聚肌苷酸和聚胞苷酸的精滤液以及稳定剂混合，其中聚肌苷酸和聚胞苷酸、稳定剂的重量比为1:1:1，保持37℃恒温下进行搅拌30min；(3)将搅拌结束后的溶液进行过滤，将滤液采用乙醇进行醇沉处理，醇沉时间为0.5-1.5h；(4)将醇沉后的物料进行离心分离，将离心后的固体产物采用乙醇浸泡脱水，真空干燥后得到聚肌胞产品，所述聚肌苷酸精滤液是在肌苷二磷酸溶液中加入MgCl2，肌苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚肌苷酸精滤液；所述聚胞苷酸的精滤液是在胞苷二磷酸溶液中加入MgCl2，胞苷二磷酸和MgCl2的摩尔比为10:1，并调整混合溶液的pH为7.0；加热聚合，在38℃下充分搅拌，并加入固化酶继续搅拌2h；聚合反应后收集反应原液，过滤后并进行清洗得到聚胞苷酸精滤液。2.根据权利要求1所述的聚肌胞的制备方法，其特征在于，所述稳定剂为硫酸卡那霉素，聚赖氨酸，葡萄糖酸钙中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的聚肌胞的制备方法，其特征在于，所述固化酶为多核苷磷酸化酶，其加入量为0.5-1.5wt％。4.根据权利要求1所述的聚肌胞的制备方法，其特征在于，所述肌苷二磷酸溶液的制备方法包括以下步骤：1)ATP脱氨制成肌苷三磷酸溶液；2)肌酐三磷酸溶液脱色处理；3)降解酶溶液的制备，配制浓度为50％的酵母溶液，调整其pH为6，在30℃下静置2天，过滤后得到降解酶溶液；4)降解...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋龙飞，
申请(专利权)人：河北韩美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13