一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用，于心血管支架材料表面修饰技术领域，所述纳米颗粒的制备过程如下：将盐酸多巴胺溶解在Tris缓冲液中，将浓度为25µg/µl‑100µg/µl的外泌体悬液按照1:5‑100体积比加至多巴胺‑Tris缓冲液中，在摇床中，4℃‑60℃，避光，40‑140圈/分，反应15分‑6h后，离心，去除上层液，保留沉积颗粒悬液，按照1:5‑100的体积比将沉积颗粒悬液加入多巴胺‑Tris缓冲液，在摇床中，4℃‑60℃，避光，40‑140圈/分，反应15分‑6h后，离心，去除上层液，所述固体即为聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒。

A kind of polydopamine-exosome core-shell nanoparticles and its modified vascular stent material and Application

【技术实现步骤摘要】
一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用
本专利技术属于心血管支架材料表面修饰
，具体涉及一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用。
技术介绍
目前，心血管疾病已成为世界范围内一个快速增长疾病，并且该疾病有很高的致死率。而使用血管内支架则是治疗冠状动脉和外周动脉疾病的重要方法，并且是最迅速的医疗干预方式。裸金属支架（BMS）是最早使用的一种心脏支架，但是放置之后会造成强烈的血小板黏附并激活凝血级联反应，同时激活的还有炎症反应和血管修复过程。这些反应会进一步诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）的迁移和增殖，从而使血管进一步狭窄。为了减少再狭窄，已开发出涂覆有抑制细胞活性的药物涂层的药物洗脱支架（DES），这些药物包括血管内皮生长因子（VEGF），释放NO的分子以及雌二醇等。在降低冠状动脉疾病的临床和血管造影再狭窄方面，由于VSMC增殖和新内膜增生被DES洗脱的细胞毒性和细胞抑制药物抑制了，因此，DES已被证明优于BMS。然而，由于支架同样也会延迟再内皮化进程，导致正常的愈合反应也降低，这就使患DES者晚期局部内皮再生和晚期血栓形成的风险显着高于BMS患者。因此，开发一种具有快速内皮化功能的血管支架就显得十分重要。已有大量研究表明，人的血管内部是由单层内皮细胞构成的，中层是VSMC，外部由结缔组织细胞（成纤维细胞等）组成。而血液与内皮细胞、收缩型平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等之间的交流，主要是依靠各类物质以及信号的传递。而外泌体正是细胞间传递信号的重要组成部分，在维持组织间稳态以及行为调控方向起到了重要的作用。外泌体，粒径尺寸一般在40nm-150nm之间，通过进入细胞内部，调控细胞行为。外泌体中包含着母细胞的RNA以及相关的蛋白质、肽段、抗原等因子，在进入细胞后，可以更加精确的地给予靶细胞以母细胞释放的良性信号，从而显著减少细胞与细胞间交流时间，迅速调控细胞活性和功能，从而起到促进材料表面快速内皮化的作用。为了将外泌体固定于心血管支架表面，则需要对外泌体进行表面改性，在不损伤外泌体本身的功能的前提下，使其具备黏附在材料表面的能力。多巴胺（Dopamine）的来源是贝类，具有良好的生物相容性，在氧气和碱性条件下，可温和的发生自聚-交联反应，可在大部分材料表面形成稳定的多巴胺聚合物薄膜（PDA），是优良的表面改性的选择。综上所述，通过PDA修饰外泌体（健康血液、干细胞、血管内皮细胞、收缩型平滑肌细胞来源），使其具备黏附性能，并进一步修饰支架表面，在心血管之间表面制备一种可以促进材料表面内皮化的修饰层。目前尚无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用。基于上述目的，本专利技术采取如下技术方案：一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将盐酸多巴胺溶解在pH值7.5~9.0的Tris缓冲液中，将初始浓度为25µg/µl~100µg/µl的外泌体悬液按照1:5~1:500体积比加至多巴胺-Tris缓冲液中，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h，以600转/min~4000转/min以及5min-30min的离心时间后，去除上清液；保留沉积颗粒悬液，按照1:5~1:100的体积比将多巴胺-Tris缓冲液再次加入沉积颗粒悬液加入中后，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h后，以600转/min~5000转/min离心及5min-30min的离心时间后，去除上层液，所得沉积颗粒即为聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒。进一步地，多巴胺-Tris缓冲液中盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/ml~3.0µg/ml，上述离心是在37℃恒温条件下进行。进一步地，所述外泌体来源于血液血清、干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞；所述外泌体粒径尺寸为40nm~150nm。当所述外泌体来源于血液血清时，具体获得过程如下：（1）不抗凝普通采血管采集人血后，4℃静置1h，凝血结束后，将真空采血管置于离心机中离心，离心条件为：转速3000rpm，5分钟，室温；（2）血清分装入1.5mL离心管，每支0.5mL，后3000g15min室温离心，取上清；（3）每250µL滴加63µLExoquick混匀；（4）4℃下静置孵育30min；（5）1500g低速离心30min；（6）去上清后，1500g5min离心；（7）PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为25µg/µl-100µg/µl（8）-80℃保存外泌体。当所述外泌体来源于干细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞时，具体获得过程如下：（1）取10mL的1×106个/mL对数生长期的骨髓间充质干细胞、心肌细胞、内皮细胞或收缩型平滑肌细胞的条件培养液，以3000g离心15分钟后，取上清；（2）ExoQuick-TC外泌体试剂盒进行外泌体提取：向条件培养基上清中加入2mL外泌体提取液，混合均匀，并在4℃条件下过夜反应（反应时间为8~16h）；（3）1500g低速离心30min，（4）去上清后，1500g5min离心，（5）使用PBS溶解沉淀物，并使用BCA试剂盒确定外泌体浓度，使得浓度为25µg/µl-100µg/µl。上述制备方法制得的聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒。利用上述聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在血管支架材料表面制备修饰层的方法，过程如下：使用tris调节PBS缓冲液的pH至7.4~9.0后，将聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒分散在该PBS缓冲液中，使聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒在PBS缓冲液中的浓度为25µg/ml~200µg/ml；将血管支架材料放入其中，使其完全浸没，30~37℃反应30分~36小时，反应完毕后吸除残余反应液，用PBS缓冲液洗净表面，即得聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒修饰的血管支架材料表面膜层。进一步地，所述血管支架材料为钛合金、不锈钢、可降解聚乳酸或高分子量（Mw3000～20000）聚乙二醇。进一步地，所述PBS缓冲液的pH为7.4。上述制备方法制得的血管支架材料。上述血管支架材料在血管支架中的应用。本专利技术的反应过程和机理主要包括以下两个部分：第一部分，使用聚多巴胺的静电逐层自组装(LbL)功能来封装单个外泌体颗粒。多巴胺的聚合过程是可以在外泌体存活的pH值环境下进行的，对外泌体本身毒性可以忽略不计，同时可以赋予外泌体新的表面功能：促进外泌体粘附在各种基体上。此外，我们设想在单个外泌体上形成聚多巴胺壳后，为后续的表面修饰提供了大量位点。有研究表明，外泌体具有正常的细胞膜结构，而这种生物相容性良好的聚多巴胺涂层正是因为与细胞壁蛋白的胺基或巯基之间形成了共价键而稳定存在的。第二部分，使用聚多巴胺-外泌体颗粒修饰心血管支架表面。聚多巴胺修饰层在有氧、碱性条件下可以引发温和的自聚-交联反应，可与材料发生螯合和自聚合反应，将内部包裹的外泌体固定于材料表面，形成修饰层。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1.通过使用多巴胺对单个外泌体的外表面进行修饰，使外泌体具备粘附性能的同时能够更好的适应外部环境，减缓外泌体在血流冲击下的释放速率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将盐酸多巴胺溶解在pH值7.5~9.0的Tris缓冲液中，将初始浓度为25µg/µl~100µg/µl的外泌体悬液按照1:5~1:500体积比加至多巴胺‑Tris缓冲液中，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h，以600转/min~4000转/min以及5min‑30min的离心时间后，去除上清液；保留沉积颗粒悬液，按照1:5~1:100的体积比将多巴胺‑Tris缓冲液再次加入沉积颗粒悬液加入中后，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h后，以600转/min~5000转/min离心及5min‑30min的离心时间后，去除上层液，所得沉积颗粒即为聚多巴胺‑外泌体核壳结构纳米颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将盐酸多巴胺溶解在pH值7.5~9.0的Tris缓冲液中，将初始浓度为25µg/µl~100µg/µl的外泌体悬液按照1:5~1:500体积比加至多巴胺-Tris缓冲液中，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h，以600转/min~4000转/min以及5min-30min的离心时间后，去除上清液；保留沉积颗粒悬液，按照1:5~1:100的体积比将多巴胺-Tris缓冲液再次加入沉积颗粒悬液加入中后，在摇床中，4℃~40℃，避光，40~140圈/分，反应15分~6h后，以600转/min~5000转/min离心及5min-30min的离心时间后，去除上层液，所得沉积颗粒即为聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒。2.根据权利要求1所述聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于，多巴胺-Tris缓冲液中盐酸多巴胺的浓度为1.0µg/ml~3.0µg/ml。3.根据权利要求1所述聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述外泌体来源于血液血清、干细胞、内皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：关绍康，侯雅尘，李敬安，张金盈，朱世杰，曹昶，王利国，王俊，常蕾，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41