胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于试剂盒技术领域，公开了一种胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂，所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂检测方法包括：血清样本的处理，采血、离心、保存备用；总RNA的提取，提取得到的总RNA放于‑80℃冰箱保存备用；进行吸光度检测，利用RNA甲醛变性胶电泳判断RNA的质量；进行反转录获得cDNA，将得到的cDNA进行荧光定量检测；采用相对定量法对检测结果进行分析。本发明专利技术与传统肿瘤标志物CEA,CA199,CA724在诊断中的效能做了评估，优于传统肿瘤标志物，miR‑30c的检测适合作为为胃癌的诊断标志物，并为胃癌诊断开发为新的肿瘤检测标志物诊断试剂盒，用于疗效评价及预后判断，具有很好的应用前景。

Diagnosis and prognostic evaluation of gastric cancer

【技术实现步骤摘要】
胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒
本专利技术属于试剂盒
，尤其涉及一种胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，在我国胃癌发病率和死亡率较高。据统计分析，2012年我国胃癌发病率为31.28/10万，死亡率为22.04/10万。胃癌发病多无明显特异性的临床表现且预后不良,五年生存率仅有20-30％，因此，寻找胃癌血清特异性标志物用于胃癌的早期诊断及治疗具有重要的意义。传统肿瘤标志物CEA,CA199,CA724在胃癌中的诊断特异性与灵敏性不高。比如CEA合成部位在胎儿的胃肠和血液，主要在结直肠癌患者中表达，其他肿瘤包括胃癌，肺癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，胰腺癌等肿瘤中也可表达，非恶性肿瘤病变如肾衰，肺气肿，直肠息肉，结肠炎时CEA表达可以升高，还会受到其他因素影响，如吸烟与唾液污染。microRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，能通过与靶标mRNA3’端非编码区完全或部分互补结合引起靶mRNA降解或抑制其翻译，从而对靶基因进行转录后调控。micr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，包括核苷酸序列mir‑30c和内参；所述miR‑30c核苷酸序列为：5′‑TGTAAACATCCTACACTCTCAGC‑3′；所述内参为U6 snRNA：U6引物上下游的引物序列5’‑CTCGCTTCGGCAGCACA‑3’与5’‑AACGCTTCACGAATTTGCGT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，包括核苷酸序列mir-30c和内参；所述miR-30c核苷酸序列为：5′-TGTAAACATCCTACACTCTCAGC-3′；所述内参为U6snRNA：U6引物上下游的引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’与5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。2.如权利要求1所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒，其特征在于，所述miR-30c相对表达量的计算方法：2-ΔCt循环值计算，ΔCt＝CtmiR-30c-CtU6。3.一种利用权利要求1所述胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法包括以下步骤：步骤一，血清样本的处理，采血、离心、保存备用；步骤二，总RNA的提取，提取得到的总RNA放于-80℃冰箱保存备用；步骤三，进行吸光度检测，利用RNA甲醛变性胶电泳判断RNA的质量；步骤四，进行反转录获得cDNA，将得到的cDNA进行荧光定量检测；步骤五，采用相对定量法对检测结果进行分析。4.如权利要求3所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤一中，血清样本的处理具体为：所有纳入人群均取清晨空腹静脉血3ml，并立即用水平离心机以2000rpm离心8min分离血清，吸出的上清置于离心管中，于4℃条件下14000xrpm离心10min，吸出的上清液置新的离心管中，放到-80℃冰箱低温保存以便用于总RNA的提取。5.如权利要求3所述的胃癌诊断及预后评估血液循环miRNA生物标志物检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤二中，总RNA的提取，具体步骤为：(1)提取总RNA；(2)加入10倍体积的裂解/结合缓冲液匀浆器彻底混匀；(3)加入1/10体积的匀浆液添加物，涡旋混匀，冰上放置10分钟；以上操作均在冰上进行；(4)加入与裂解液相同体积的酸性-苯酚：氯仿，300ul裂解液/300ul酸性-苯酚：氯仿，涡旋30-60秒，室温10，000g离心5分钟，分相不好,重新离心；取上清置一新管中，记体积；(5)加入1.25倍体积100％乙醇，涡旋混均，反复过纯化柱，体积不超过700ul，10，000g离心约15秒；(6)加入350ul洗液1，离心5-10秒，清洗纯化拄，10，000g离心约15秒，弃过滤液；(7)DNaseI10μl和BufferRDD70μl加入膜上，20-30℃放置15分钟；(8)加入350ul洗液1,离心5-10秒，清洗纯化拄，10，000g离心15秒，弃过滤液；(9)加入500ul，洗液，2/3，离心5-10，秒，清洗纯化柱二次，10，...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟永平，卫星，王振飞，贺晓花，侯婧，田晓燕，米澜，陈永霞，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学附属人民医院内蒙古自治区肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15