基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料及其制备方法，包括如下制备步骤：(1)采用非酶解冷提法从鹿茸中提取天然活性成分鹿茸小分子多肽以及活性多糖，并从不溶性提取滤渣中获取脱脂鹿茸粉；(2)制备含纳米磷酸三钙的明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料；(3)制备鹿茸小分子多肽‑纳米羟基磷灰石微球复合物；(4)材料成型。与现有技术相比，本发明专利技术对鹿茸进行了深度加工利用，操作简单便捷，所得促骨愈合材料具有骨诱导作用，可促进拔牙创部位的牙槽骨成骨愈合。

Bone Healing Promoting Material Based on Natural Active Components of Antler and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料及其制备方法
本专利技术属于医用组织工程材料领域，具体地说，涉及含鹿茸综合深加工制品的材料、制备方法及其应用。
技术介绍
鹿茸含有多种生物活性物质，成分极其复杂，主要有无机成分及有机成分，有机成分可分为水溶性、脂溶性和不溶性物质。其中水溶性成分主要包括氨基酸、多肽、蛋白质、活性多糖等；脂溶性成分主要有磷脂、甾体化合物，以及脂肪酸、中性脂和前列腺素等。不溶性成分主要包括角蛋白、胶原蛋白等物质。其中富含的蛋白质及多肽类，除了增强免疫功能，还具有促进机体生长发育、促进骨折愈合等效果。此外鹿茸还富含有硫酸软骨素类多糖。现有研究表明，鹿茸多肽在骨再生及修复方面具有明显效果，例如林建华等研究发现鹿茸多肽可促进软骨细胞增殖，并对其机制进行了研究(《中华创伤骨科杂志》，2007)；董万超等在梅花鹿二杠茸中分离出了鹿茸多肽，实验表明其有抗炎、促生长的作用(《特产研究》，2000)。此外还发现鹿茸多肽具有抗炎活性、促进细胞增殖及修复神经损伤等生物学效应，且具有天然、安全、高效、成本低等特点。例如周秋丽(《天然产物研究与开发》，1998)采用质谱等分离分析手段测得鹿茸天然多肽的分子量在1000-3000Da左右，对骨折有明显促愈合作用，它是通过促进骨、软骨细胞增殖及促进骨痴内骨胶原的积累和钙盐沉积而加速骨折愈合；且发现多肽是鹿茸抗炎镇痛的物质基础，对各种急慢性炎症具有明显的抑制作用。现有技术还发现鹿茸多肽能明显刺激软骨细胞和成骨样细胞的增殖，其增殖作用有明显的量效关系且无种属特异性。近年来，鹿茸多糖也非常受关注。鹿茸中含有的硫酸软骨素、酸性多糖、粘多糖等活性多糖具有类似BMPs诱发骨形成的效果，其多糖活性优于商品硫酸软骨素。由于鹿茸多肽具有上述优点，使其尤其适合用于制备促骨愈合材料用途。然而，现有技术对这方面的报道较少，主要集中在鹿茸活性组分的提取、保健品的制备。简单列举如下。CN109306367A公开了一种鹿茸磷酸肽的制备方法及应用，将鹿茸酶解、鹿茸磷酸肽富集、纯化，制备成鹿茸磷酸肽；其鹿茸肽制备方法为：将新鲜鹿茸冷冻干燥后粉碎，加入鹿茸质量10～50倍的去离子水，用1～6M的HCl将pH调至1.0～5.0，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％的蛋白酶A，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时；酶解结束后用1～6M的NaOH将pH调节至4.0～8.0，再加入鹿茸质量0.1～5.0％的蛋白酶B，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，反应结束后将温度升至80～100℃并保温10～30分钟。CN107574204A公开了一种鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，其特征在于：将鹿骨脱脂、酶解，利用吸附材料富集具有螯合功能的肽，将螯合肽与人体所需的金属离子反应，制备成鹿骨肽螯合金属离子。通过酶解将鹿骨中蛋白质降解，利用固定化亲和色谱材料富集具有螯合功能的肽，螯合肽可与不同的金属离子反应制备成为具有不同功效的鹿骨肽螯合金属离子，可用作人体金属元素补充剂。CN106860913A提供了一种鹿茸多肽的应用、牙种植体及其表面处理方法，涉及口腔种植
，包括将鹿茸多肽溶于三蒸水中，制成鹿茸多肽溶液，将鹿茸多肽溶液涂抹在牙种植体的表面，然后将牙种植体种植于牙槽骨，其活性小肽有助于牙种植体与骨的结合速度，缩短治疗疗程。但是，该方法直接将鹿茸多肽溶液涂抹在牙种植体的表面，效果差且持续生效时间短，有效组分易流失。CN105031606A涉及多肽类生物药物领域，具体提供一种鹿茸多肽混合物及其制备方法与应用。所述鹿茸多肽混合物的制备方法包括如下步骤：1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。所述鹿茸多肽混合物的主要组分为Ala-His-Gly，Ala-His-Trp-Lys，Val-His，Leu-Ala-Gln，Ile-Ala，Ala-Tyr，Ala-Leu和Thr-Leu。提供的鹿茸多肽混合物具有抗炎活性，可用于炎症的防治，且其具有天然、安全、高效、成本低等特点，可用于功能性食品、保健品、动物食品及饲料等领域。CN108588158A公开了鹿茸深加工的方法，具体涉及一种分离制备鹿茸多肽和多糖的方法，包括：鹿茸样品经预处理、Alcalase酶解、醇沉、超滤、纳滤、浓缩、干制获得鹿茸多肽和多糖。该方法所制备多肽主要应用于食品、保健品等领域。然而，该方法所得多肽为多次酶解获取，需要连续操作，操作过程繁琐、成本高。此外，其酶解过程采用的高温加热手段容易破坏鹿茸的有效活性成分。CN109485692A公开了一种鹿茸蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：将鹿茸粉末脱脂后，用低浓度乙醇溶液进行回流提取，并离心，收集上清液，静置过夜，再将溶液乙醇浓度调高直至蛋白析出，低温离心得沉淀，将沉淀进行真空冷冻干燥，即得到淡黄色蓬松鹿茸蛋白提取物。由于鹿茸组分在制备促骨愈合材料中的优势，使其可用于牙科治疗领域。目前拔牙和口腔种植修复是常见的牙科治疗行为，但是由于牙槽骨骨质、骨量的差异，很多患者拔牙后出现牙槽骨吸收或骨质疏松导致的成骨困难。因此牙槽骨的骨再生是口腔医学的一大难题。这是由于临床上拔牙后在拔牙创愈合过程中，创口附近细胞以不同速度进入缺损区，一些细胞例如上皮细胞和结缔组织细胞比成骨细胞(胶原纤维细胞)生长快，造成软组织占据拔牙创主要部位，在临床上表现为牙槽骨的吸收，高度降低、宽度减少。而良好的牙槽骨嵴形态对种植修复效果具有重要的作用，因此，开发减少牙槽骨萎缩吸收的具有重要健康价值和市场价值。综上，现有技术鹿茸深加工制品主要应用于食品、保健品、化妆品领域，缺乏用于医用生物工程组织材料尤其是促骨愈合外用材料的报道。因此，通过适当的办法实现对鹿茸有效组分在体内持续释药周期的有效控制，从而延长有效作用时间使得接近骨愈合的时间十分有必要。另外，现有技术中的加工提取方法存在鹿茸综合利用度不高、采用高温加热导致破坏天然有效活性成分、仅注重获取某一组分而导致有效组分提取利用率不高、提取步骤连续性差等缺点，因此，有必要探索一种简便、有效的办法，以实现高效的鹿茸有效组分综合提取。因此，高效利用鹿茸资源，开发相关的医用生物工程组织材料，具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料及其制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供鹿茸天然活性组分的提取方法。本专利技术的另一个目的在于提供所述促骨愈合材料在骨愈合尤其是牙槽骨愈合中的应用。本专利技术的技术方案如下。第一方面，提供一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料，其通过如下方法制备得到：(1)采用非酶解冷提法从鹿茸中提取天然活性成分鹿茸小分子多肽以及活性多糖，并从不溶性提取滤渣中获取脱脂鹿茸粉；其主要步骤为：S1：在低温和缓冲液存在条件下冷提取鹿茸水溶性组分，得到鹿茸粗提物，过滤；S2：对滤渣进行脱脂处理得到脱脂鹿茸粉；S3：柱层析分离，得到小分子多肽组分及多糖组分；S4：对多糖进行纯化处理得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖；(2)制备含纳米磷酸三钙的明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料；(3)制备鹿茸小分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用非酶解冷提法从鹿茸中提取天然活性成分鹿茸小分子多肽以及活性多糖，并从不溶性提取滤渣中获取脱脂鹿茸粉；其主要步骤为：S1：在低温和缓冲液存在条件下冷提取鹿茸水溶性组分，得到鹿茸粗提物，过滤；S2：对滤渣进行脱脂处理得到脱脂鹿茸粉；S3：柱层析分离，得到小分子多肽组分及多糖组分；S4：对多糖进行纯化处理得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖；(2)制备含纳米磷酸三钙的明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料；(3)制备鹿茸小分子多肽‑纳米羟基磷灰石微球复合物；(4)材料成型：将所得小分子多肽‑纳米羟基磷灰石微球复合物用0.5‑1wt％的鹿茸活性多糖溶液分散，形成分散液；将明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料置于分散液中，在4℃条件下，使其负载微球复合物及活性多糖组分，真空冷冻干燥，得到所述基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料。

【技术特征摘要】
1.一种基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用非酶解冷提法从鹿茸中提取天然活性成分鹿茸小分子多肽以及活性多糖，并从不溶性提取滤渣中获取脱脂鹿茸粉；其主要步骤为：S1：在低温和缓冲液存在条件下冷提取鹿茸水溶性组分，得到鹿茸粗提物，过滤；S2：对滤渣进行脱脂处理得到脱脂鹿茸粉；S3：柱层析分离，得到小分子多肽组分及多糖组分；S4：对多糖进行纯化处理得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖；(2)制备含纳米磷酸三钙的明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料；(3)制备鹿茸小分子多肽-纳米羟基磷灰石微球复合物；(4)材料成型：将所得小分子多肽-纳米羟基磷灰石微球复合物用0.5-1wt％的鹿茸活性多糖溶液分散，形成分散液；将明胶基/脱脂鹿茸粉骨架材料置于分散液中，在4℃条件下，使其负载微球复合物及活性多糖组分，真空冷冻干燥，得到所述基于鹿茸天然活性组分的促骨愈合材料。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体操作如下：S1：取冷冻梅花鹿鲜茸，切片，加入预冷至4℃的提取缓冲液，组织粉碎后匀浆1-3h，匀浆期间补充缓冲液，匀浆后于4℃温度下低速搅拌12-16h；搅拌混合液于4℃下离心15-20min，收集上清液组分；所得沉淀用缓冲液重悬，搅拌1-2h后再次离心，合并上清组分，微滤膜过滤除杂；低温真空浓缩，得鹿茸粗提物浓缩液；其中，所述缓冲液组成为：NaCI，Tris-HCl，醋酸钠，pH6.7-6.8；优选地，鲜茸与总缓冲液的用量比为1kg:5-10L；S2：将离心沉淀依次用乙醚、乙酸乙酯脱脂处理，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸发回收溶剂，所得滤渣即为富含胶原等不溶性组分的脱脂鹿茸骨粉，冷冻干燥保存；S3：将鹿茸粗提物浓缩液进行柱层析，去离子水洗脱，紫外监测多肽活性峰，收集非紫外部分水溶性组分1，以及含蛋白及多肽的组分2；将组分2合并后浓缩，超滤膜过滤，收集滤液，纳滤膜除盐，获得小分子多肽组分，减压浓缩，真空冷冻干燥得到多肽干粉，低温保存；优选地，将组分2用截留分子量为3000-4000Da的纤维超滤膜过滤；S4：将含多糖及无机矿物质的水溶性组分1合并后浓缩，透析除去小分子杂质，得到活性多糖粗品；将多糖粗品透析液加入无水乙醇进行醇沉处理，离心收集沉淀，洗涤，干燥，得到富含硫酸软骨素类蛋白聚糖的鹿茸活性多糖组分；优选地，所述透析用截留分子量为8-10KDa的透析袋进行透析。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体操作如下：S1：按质量比10:0-3的比例将明胶和水溶性组分2中分离小分子多肽后的蛋白滤渣配制成3-5wt％的分散液，加入纳米磷酸三钙至质量分数0.5-1.5wt％，50℃高速匀浆0.5-1min，然后室温静置冷却；S2：向上述混合物中加入交联剂溶液，混合溶液与交联剂溶液体积用量比为20-50:1，搅拌条件下于37-42℃交联15-30min，交联反应后加入上述制备的脱脂鹿茸粉至质量分...

【专利技术属性】
技术研发人员：华琴，华星，陈月红，华钦，陈仁娟，
申请(专利权)人：福建省华杭生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35