一种生物活性水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种生物活性水凝胶及其制备方法和应用，属于水凝胶制备技术领域，所述制备方法以脱细胞角膜为核体材料，采用盐酸和胃蛋白酶溶解脱细胞猪角膜，1‑环己烷基‑3‑(2‑吗啉代‑乙基)‑碳化二亚胺‑N‑甲基‑P‑苯‑硫酸(CMC)为交联剂，N‑羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)辅助提高交联效率，22～28℃交联8～12min得到生物活性水凝胶。本发明专利技术制备的水凝胶具有多孔结构、透明度高、可注射；含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持细胞生长，可应用于角膜浅基质损伤的治疗，具有较大的临床应用潜力。

A Bioactive Hydrogel and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种生物活性水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术涉及水凝胶制备
，尤其涉及一种生物活性水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
角膜是人眼睛表面的一个透明的，无血管的组织，它保护眼睛免受外部环境和病原体的伤害，其完整性对于正常视觉非常重要。许多角膜损伤和疾病，如化学性、热烧伤、Stevens-Johnson，s综合征、眼瘢痕性天疱疮、角膜溃疡和Fuch,s角膜内皮营养不良，都会影响角膜透明度，造成角膜瘢痕或者浑浊，从而引起视力减退，甚至失明。目前角膜疾病传统的治疗手段是眼药水，但是眼药水有许多限制性的缺点，比如滴进眼睛里不充分，容易流到外面、泪囊或者结膜囊中而损失作用的药物浓度。水凝胶是由亲水性聚合物构成的，能在水或生物体液中溶胀并保持大量水分而不被溶解的交联网络。水凝胶结构类似于机体组织，既不影响生命体的代谢过程，代谢产物又可以通过水凝胶排出，因此常常被用作人体器官/组织替代物。目前水凝肢，作为在损伤修复材料界一种特殊的吸附剂，受到了很多关注。现有技术表明壳聚糖-明胶水凝胶能够促进角膜损伤修复。但是，壳聚糖-明胶水凝胶修复的上皮的结构和功能都远远低于正常角膜上皮，需要额外添加生长因子，并且透明度较差。并且虽然此类水凝胶具有温敏特性，4℃为液体，37℃为水凝胶，但是眼表温度很难达到37℃。因此寻找一种具有良好透明度、可注射、可常温成胶的生物活性水凝胶，以提高角膜组织修复质量是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生物活性水凝胶及其制备方法和应用，该生物活性水凝胶具有多孔结构、良好的透明度，能够常温成胶。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种生物活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1)将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合，得到脱细胞猪角膜水凝胶前驱液；2)调节所述脱细胞猪角膜水凝胶前驱液的pH值至7.2～7.4后和交联剂混合，在22～28℃条件下交联8～12min，得到生物活性水凝胶；步骤2)中所述交联剂溶液的组分包括10×PBS缓冲液、1-环己烷基-3-(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐；优选的，在步骤1)所述将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合前，还包括对脱细胞猪角膜进行冷冻干燥。优选的，所述冷冻干燥的温度为-60～-50℃；所述冷冻干燥的时间为20-30h。优选的，步骤1)中所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.05～0.15M。优选的，步骤1)中所述脱细胞猪角膜水凝胶前驱液中脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液的体积比为25～35:0.5～1.5:0.5～1.5。优选的，步骤2)所述交联剂溶液中(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的摩尔当量比为0.5～1.5:0.5～1.5。优选的，步骤2)所述交联剂溶液中(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的浓度为0.1～0.5mmol/ml。优选的，步骤2)所述生物活性水凝胶中脱细胞水凝胶前驱液和(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸/N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐交联剂溶液的体积比为4～6:0.5～1.5。本专利技术还提供了上述方案所述制备方法制备得到的脱细胞猪角膜生物活性水凝胶。本专利技术还提供了上述方案所述生物活性水凝胶在制备治疗角膜浅基质损伤的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种生物活性水凝胶的制备方法，所述制备方法以脱细胞角膜为核体材料，采用盐酸和胃蛋白酶溶解脱细胞猪角膜，CMC为交联剂，NHS辅助提高交联效率，22～28℃交联8～12min得到生物活性水凝胶。与现有水凝胶相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术方法所用的角膜材料来源于猪眼球，来源广泛，成本低。2、本专利技术所使用的脱细胞猪角膜成品脱细胞彻底同时保留了生物活性物质胶原(Collagen)，糖胺聚糖(GAG)等成分，物理结构和化学行为更接近人角膜。3、本专利技术所述的脱细胞角膜生物活性水凝胶，使用水溶性碳二亚胺交联剂(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸(CMC)，与N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS)联合使用提高交联效率，碳二酰亚胺交联剂具有毒性低的优点，因为它们本身不会成为最终交联产物的一部分,因此，原则上不存在毒性降解产物释放到组织中的可能性。CMC作用温和，能够常温成胶，操作方便，扩大了临床应用范围。4、本专利技术所述的脱细胞角膜生物活性水凝胶，在成分含量等方面更接近人角膜，具有多孔结构、良好的透明度，能够常温成胶并且可以注射，用于治疗浅基质角膜损伤能够提高损伤角膜基质层的结构和功能，促进角膜上皮修复，减少瘢痕和浑浊发生。附图说明：图1为实施例1中加入交联剂前后的透明可注射生物活性水凝胶照片，其中图1-a为脱细胞猪角膜溶液，图1-b为脱细胞猪角膜水凝胶(加入交联剂后)；图2为实施例2中置于打印有黑色A字纸上显示生物活性水凝胶透明度的图片，其中图2-a为实施例1制备的生物活性水凝胶的透光检测结果；图2-b为新鲜猪角膜基质透光检测结果；图3为实施例3中生物活性水凝胶扫面电镜图；图4为实施例4中生物活性水凝胶Collagen含量(a)和GAG含量(b)图；其中图4-a为实施例1制备的生物活性水凝胶的Collagen含量，图4-b为实施例1制备的生物活性水凝胶的GAG含量；图5为实施例5中生物活性水凝胶注射到兔角膜浅基质损伤模型修复损伤，其中图5-a，图5-b为构建3.5mm环钻制备1/3浅基质损伤模型；图5-c为形成生物活性水凝；图5-d为3天时缺损的角膜上皮完全修复；图5-e为阴性对照组7天时缺损的角膜上皮完全修复；图5-f为不同修复试剂修复角膜上皮对比情况。具体实施方式本专利技术提供了一种生物活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1)将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合，得到脱细胞猪角膜水凝胶前驱液；2)调节所述脱细胞猪角膜水凝胶前驱液的pH值至7.2～7.4后和交联剂混合，在22～28℃条件下交联8～12min，得到生物活性水凝胶；步骤2)中所述交联剂溶液的组分包括10×PBS缓冲液、CMC和NHS。本专利技术中，所有制备过程在无菌环境中进行，并要求所有试剂必须经过灭菌或细菌过滤器过滤处理。本专利技术中，在将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合前，优选的还包括对脱细胞猪角膜进行冷冻干燥；所述脱细胞猪角膜的制备方法参见专利ZL201610513270.1；所述冷冻干燥的温度优选为-60～-50℃，更优选为-55℃；所述冷冻干燥的时间优选为20～30h，更优选为24h；所述冷冻干燥的方式优选为真空冷冻干燥；所述干燥的设备优选为真空冷冻干燥机；本专利技术在对脱细胞猪角膜进行干燥后，优选的还包括对干燥后的脱细胞猪角膜进行粉碎；所述粉碎的方式优选为组织研磨仪粉碎；更优选的为组织研磨仪粉碎5min，获得脱细胞猪角膜粉末。本专利技术对干燥后的脱细胞猪角膜进行粉碎后，将粉碎后的脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合，所述混合的方式优选为搅拌混合；所述搅拌混合采用的设备优选为磁力搅拌器，更优选的搅拌时间为24h。得到脱细胞猪角膜水凝胶前驱液；所述盐酸水溶液中盐酸的浓度优选为0.05～0.15M，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1)将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合，得到脱细胞猪角膜水凝胶前驱液；2)调节所述脱细胞猪角膜水凝胶前驱液的pH值至7.2～7.4后和交联剂混合，在22～28℃条件下交联8～12min，得到生物活性水凝胶；步骤2)中所述交联剂溶液的组分包括10×PBS缓冲液、1‑环己烷基‑3‑(2‑吗啉代‑乙基)‑碳化二亚胺‑N‑甲基‑P‑苯‑硫酸和N‑羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。

【技术特征摘要】
1.一种生物活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1)将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合，得到脱细胞猪角膜水凝胶前驱液；2)调节所述脱细胞猪角膜水凝胶前驱液的pH值至7.2～7.4后和交联剂混合，在22～28℃条件下交联8～12min，得到生物活性水凝胶；步骤2)中所述交联剂溶液的组分包括10×PBS缓冲液、1-环己烷基-3-(2-吗啉代-乙基)-碳化二亚胺-N-甲基-P-苯-硫酸和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)所述将脱细胞猪角膜、胃蛋白酶和盐酸水溶液混合前，还包括对脱细胞猪角膜进行冷冻干燥。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的温度为-60～-50℃；所述冷冻干燥的时间为20～30h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述盐酸水溶液中盐酸的浓度为0.05～0.15M。5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述脱细胞猪角膜水凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢立信，史伟云，周庆军，王付燕，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37