鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用技术

本发明专利技术属于医药学技术领域，公开了一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用，所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法为：依次进行细胞凋亡检测，Hoechst 33258染色，线粒体膜电位染色，活性氧种类测定，实时荧光定量PCR分析，蛋白质印迹分析（Image J灰度分析定量），数据统计分析。本发明专利技术表明鸡骨香挥发油通过线粒体介导的内源途径诱导A549细胞凋亡，能诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，是一种潜在的抗癌药物；因此，这些证据表明鸡骨香挥发油可作为一种新型化学预防或化学治疗剂用于癌症的治疗，为进一步开发用于临床分析的药物提供依据。

Test method and application of anti-tumor activity and related mechanism of volatile oil from Chicken Bone Fragrance

【技术实现步骤摘要】
鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用
本专利技术属于医药学
，尤其涉及一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：挥发油是从植物中获得的天然化合物，其成分因其相对安全的状态，消费者的广泛接受以及对潜在功能用途的探索而越来越受到关注[1-3]。挥发油通常成为评估传统医学疗效的重要指标[4]。从植物中提取的约300种挥发油在农业，食品，化妆品和健康产业中很重要[5]。癌症是一个主要的公共卫生问题，是心血管疾病之后的第二大全球性疾病。根据美国癌症协会的统计，美国总共估计有1,685,210例新发癌症病例，2016年约有600,000例死亡病例[6]。迫切需要发现高效且具有低毒性的新型治疗药物。巴豆属属于大戟科，由大约1300种物种组成，广泛分布于热带和亚热带地区[7]。该属植物是多种结构类型二萜的丰富来源，包括具有广泛生物活性的clerodane，trachlobane，kaurane，crotofolane和pimarane，对人类健康是有益处的。此外，三萜类化合物，黄酮类化合物和生物碱也曾在巴豆中发现[8]。CrotoncrassifoliusGeisel属于巴豆属，是一种经济上重要的草本植物，广泛种植于中国广东，福建和海南省，作为中药的商业生产[8]。自古以来，它的根源，在中国被称为“鸡骨香”，已被用于处方治疗胃痛，风湿病，喉咙痛和癌症。在先前分析C.Crassifolius根的化学成分的分析中，鉴定了不同类型的二萜，根据它们的结构类型可分为clerodane，daphnane和tigliane型[9,10]。植物内活性物质决定了植物的功效，前期与C.crassifolius相关的大量研究基本上都集中于中极性提取物成分研究，而对于C.crassifolius内的挥发性成分研究甚少，仅有很少的研究对比分析了超临界萃取与水蒸气蒸馏获得的鸡骨香萃取物的抑制肿瘤细胞生长的作用，对于鸡骨香二氧化碳超临界萃取物的成分，以及抗肿瘤作用的机制尚未报道。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)鸡骨香CO2超临界萃取物所含的具体成分尚不清楚；(2)鸡骨香CO2超临界萃取物尽管之前报道过能够抑制肿瘤细胞增长，但是对于人正常细胞的作用如何尚不清楚；(3)鸡骨香CO2超临界萃取物尽管之前报道过能够抑制肿瘤细胞增长，但是具体的作用机制如：阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、诱导细胞自噬等尚未有人研究。解决上述技术问题的难度：挥发性成分结构类型非常复杂，且化合物之间的区别较小，不易分离，通过GC-MS分析，仅仅进行简单的保留时间比对很难准确鉴定单个成分。结合多种分析手段(正构烷烃标准品分析，MS片段分析等)，对获得的超临界萃取物进行成分鉴定难度较大。解决上述技术问题的意义：挥发油是从植物中获得的天然化合物，其成分因其相对安全的状态，消费者的广泛接受以及对潜在功能用途的探索而越来越受到关注。挥发油通常成为评估传统医学疗效的重要指标。鸡骨香作为一种重要的经济作物在国内被广泛种植，但由于产量增大以及政府引导，效益逐年下滑，寻找鸡骨香产业新的经济增长点意义重大。从自然资源中寻找预防和干预癌症的天然功能因子是天然药物研究的重点，本技术中发现在相同处理浓度和时间的条件下，鸡骨香挥发油对正常细胞无明显影响，这对临床应用上具有重要意义。诱导肿瘤细胞凋亡将是一种有效的抑制癌细胞增殖和筛选抗癌药物的手段。如果上述问题得以解决，鸡骨香挥发油主要活性成分作为新型抗癌药物的开发提供理论依据。[1]C.Brasesco,L.Gende,P.Negri,N.Szawarski,A.Iglesias,M.Eguaras,S.Ruffinengo,M.Maggi,JApicSci61(2017)203-215.[2]J.Rakmai,B.Cheirsilp,J.C.Mejuto,J.Simal-Gandara,A.Torrado-Agrasar,IndCropProd111(2018)219-225.[3]R.A.Babahmad,A.Aghraz,A.Boutafda,E.G.Papazoglou,P.A.Tarantilis,C.Kanakis,M.Hafidi,Y.Ouhdouch,A.Outzourhit,A.Ouhammou,IndCropProd121(2018)405-410.[4]Q.H.Zhang,Z.P.Wang,Food&Drug11(2009)62-64.[5]J.S.Raut,S.M.Karuppayil,Bioprospectingofplantessentialoilsformedicinaluses,2014.[6]H.Turkez,O.O.Tozlu,T.C.Lima,A.E.M.D.Brito,D.P.D.Sousa,OxidativeMedicine&CellularLongevity2018(2018)1-12.[7]A.Salatino,M.L.F.Salatino,G.Negri,JBrazilChemSoc18(2007)11-33.[8]H.X.Qiu,FloraRepublicaePopularisSinicae,SciencePress:Beijing1996.[9]Q.Q.Yuan,S.Tang,W.B.Song,W.Q.Wang,M.Huang,L.J.Xuan,JNatProd80(2017)254-260.[10]G.C.Wang,J.G.Li,G.Q.Li,J.J.Xu,X.Wu,W.C.Ye,Y.L.Li,JNatProd75(2012)2188-2192.[11]M.Sylvestre,A.Pichette,A.Longtin,F.Nagau,J.Legault,JEthnopharmacol103(2006)99-102.[12]V.Oakes,W.L.Wang,B.Harrington,W.J.Lee,H.Beamish,K.M.Chia,A.Pinder,H.Goto,M.Inagaki,S.Pavey,B.Gabrielli,CellCycle13(2014)3302-3311.[13]M.M.Koseoglu,L.M.Graves,W.F.Marzluff,Molecular&CellularBiology28(2008)4469-4479.
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用。本专利技术是这样实现的，一种鸡骨香挥发油(CCEO)抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方包括：第一步，细胞凋亡检测，采用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶实验测定细胞凋亡。第二步，Hoechst33258染色，检测凋亡细胞的形态学评估。第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色，进行细胞死亡检测。第四步，线粒体膜电位染色，采用JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化。第五步，活性氧种类测定，通过2,7-二氯荧光素二乙酸酯氧化敏感性荧光探针评估ROS的产生。第六步，实时荧光定量PCR分析，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，使用逆转录本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法包括：第一步，细胞凋亡检测，采用膜联蛋白V‑FITC /碘化丙啶试验测定细胞凋亡；第二步，Hoechst 33258染色，检测凋亡细胞的形态学评估；第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色，进行细胞死亡检测；第四步，线粒体膜电位染色，采用JC‑1检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化；第五步，活性氧种类测定，通过2,7‑二氯荧光素二乙酸酯氧化敏感性荧光探针评估ROS的产生；第六步，实时荧光定量PCR分析，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA，随后进行PCR反应；第七步，蛋白质印迹分析，并通过Image J软件对目的蛋白条带进行灰度分析；第八步，统计分析，使用t检验进行数据组之间的差异检测。

【技术特征摘要】
1.一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法包括：第一步，细胞凋亡检测，采用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶试验测定细胞凋亡；第二步，Hoechst33258染色，检测凋亡细胞的形态学评估；第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色，进行细胞死亡检测；第四步，线粒体膜电位染色，采用JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化；第五步，活性氧种类测定，通过2,7-二氯荧光素二乙酸酯氧化敏感性荧光探针评估ROS的产生；第六步，实时荧光定量PCR分析，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA，随后进行PCR反应；第七步，蛋白质印迹分析，并通过ImageJ软件对目的蛋白条带进行灰度分析；第八步，统计分析，使用t检验进行数据组之间的差异检测。2.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第一步，细胞凋亡检测包括：用0,15,25,35μg/mL不同浓度的鸡骨香挥发油处理A549细胞48小时；将细胞消化并重悬浮于膜联蛋白V-FITC结合缓冲液中，加入膜联蛋白V-FITC和PI试剂，并在室温下避光孵育；通过流式细胞术检测染色的细胞。3.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第二步，Hoechst33258染色包括：将细胞接种在12孔板中用0,15,25,35μg/mL不同浓度的鸡骨香挥发油处理细胞48小时；将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟；用PBS洗涤两次后，用Hoechst33258将细胞染色；并分析细胞核的形态变化。4.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色包括：将A549细胞接种在12孔培养板中；并用含有0,15,25,35μg/mL不同浓度鸡骨香挥发油处理48小时后，将1mL、浓度100μg/mL的AO/EB染色加入到每个孔中，避光孵育，检测染色的细胞。5.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第四步，线粒体膜电位染色包括：细胞接种在6孔板用0μg/mL、15μg/mL、25μg/mL和35μg/mL鸡骨香挥发油处理细胞48小时，加入JC-1试剂，并检测结果。6.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第五步，活性氧种类测定包括：接种在6孔板用0,15μg/mL,25μg/mL和35μg/mL鸡骨香挥发油处理细胞48小时；加入MDCFH-DA试剂温育30分钟；用荧光分光光度计检测细胞内DCF的荧光，激发=488nm；发射=521nm；第六步，实时荧光定量PCR分析包括：使用SYBRPremixExTaqII在AppliedBiosystems7500实时PCR系统上进...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，孙金月，张瑞瑞，王青，程安玮，王新坤，郭溆，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37