一种制备心肌补片的方法及其应用技术

本发明专利技术为提供了一种制备心肌补片的方法，所述方法包括：(1)制备心肌补片材料；(2)采用介电电泳控制细胞在补片材料均匀排布。通过采用介电电泳对细胞进行控制，是细胞均匀的分布于心肌补片材料中，提高了细胞在材料的增殖效率，除此之外，还可以根据心肌梗死部位的性状，对补片材料上的细胞排布进行调整，采用更小的补片，实现梗死部位的全覆盖，更好的达到治疗心肌梗死的效果。为现有技术提供了一种可以产业上应用的，性能优良的，能更好的恢复心肌梗死部位活性的心肌补片，具有良好的市场前景和社会公益价值。

A Method for Preparing Myocardial Patches and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种制备心肌补片的方法及其应用
本专利技术属于生物材料
，具体而言，涉及一种制备心肌补片的方法及其应用。
技术介绍
缺血性心脏病作为我国主要健康问题之一，给我国及世界其他国家带来了沉重的经济负担。心肌细胞是一种终末分化的细胞，坏死后难以再生。尽管目前的药物，介入以及外科手术治疗缺血性心脏病可以有效的改善心肌供血，挽救濒死心肌，可是对于已经造成死亡的无功能心肌并没有修复作用。大面积的心肌死亡可引起的严重的心律失常、心衰以及心肌骤停。对于晚期心脏病的治疗，目前较为有效的方法是心肌移植。但是心肌移植的供体数量少，强烈的免疫排斥反应等因素增加了医疗成本并导致很难在临床上大范围应用。干细胞或心肌细胞的植入作为一种细胞治疗手段，为治疗心肌梗塞提供了一种极具潜力的解决方案，而干细胞植入作为一种细胞治疗手段，为治疗心肌梗塞提供了一种极具潜力的解决方案。目前已经有很多临床研究充分证实干细胞植入可以改善心梗患者的心肌功能。但是干细胞或心肌细胞的植入治疗最大的瓶颈在于细胞植入后容易大量流失，无法聚集在治疗靶点，而且长期存活率非常低，这些都严重影响临床疗效。为了解决这个问题，科研人员设想将干细胞与某种生物材料复合后，再植入到心肌梗死的部位或者固定到心肌梗死区域，就此，提出了心肌补片的概念。因此，通过组织工程手段制备心肌补片产品引起了国内外专家的重视：使干细胞或心肌细胞按照一定的空间顺序排列形成细胞片层结构，可更准确地作用于心肌梗死区域，提高细胞停留率与存活率，避免过多干细胞的流失，提高治疗效果，降低治疗风险。理想的心肌补片通常具有以下特点：作为心肌补片的细胞支撑材料具有良好的弹性、可延展性、稳定性、可塑性和有一定的机械强度，不会因必肌细胞的跳动损坏支架。作为心肌补片的细胞支撑材料具有良好的生物相容性，在体内不引起炎症反应、毒性反应和免疫排斥反应，当心肌补片移植到动物模型体内，不会因心脏高速和高强度的跳动而脱离心肌梗死部位。心肌补片的细胞支撑材料具有同步收缩的能力和良好的导电性能进行生物电传导并避免移植体内后发生严重的心律失常。心肌梗死往往伴随着局部缺血、缺氧和炎症微环境等特征，进而梗死部分有大量氧自由基(ROS)的产生，从而引起细胞的损失加重疾病的发生。心肌补片的细胞支撑材料应具有良好清除微环境中的ROS的能力。目前大多数心肌补片并不能具有上述所有的特性。现有技术中，通常采用天然聚合物作为心肌修补具有良好的生物相容性，例如，明胶，海藻酸钠，I型胶原和纤维蛋白，但是其弹性较弱，压缩后不易回复原有形状。大孔壳聚糖－明胶冷冻凝胶具有良好的弹性特性，但其导电性能微弱。而合成水凝胶包括聚丙烯酸(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)，是在人工条件下通过加成反应、开环聚合等反应制备成的交联聚合物体系。合成水凝胶具有易工业化生产和化学改性，性能可精确调控等优点，而且具有良好机械延展性，但与天然水凝胶相比，缺少细胞粘附位点，其生物相容性和生物降解性较差。为了获得能在体内发挥良好性能的心肌补片材料，研究人员通常采用多种物质混合的方式，来获得具有多种性能的材料。现有技术中通常会采用静电纺丝纳米纤维，如PHBV、PANi和PVDF作为心肌补片的支架材料，虽然这样的材料可以获得稳定的、孔隙率高的补片，但是上述材料的生物相容性较长，细胞在其上生长的状态并不理想。为了克服这些问题，有现有技术采用基于明胶的水凝胶和聚吡咯组合制备支架，虽然，其有良好的细胞相容性和电导性，但是，其机械性能较差，制备过程中容易破碎，而上述材料本身并不具有清除ROS的能力，这就导致了其难以在体内更好恢复心肌梗死部位的活性。除了致力于改进心肌补片的材料外，如何将不同的构建方法有机结合运用，构建出满足临床治疗应用需求的心肌补片产品，也是组织工程领域的研究热点。组织工程心肌补片经体外构建培养后移植到梗死心肌表面，一方面依靠种子细胞的旁分泌作用，向梗死心肌区域分泌各种生长因子、细胞因子，诱导心肌细胞的增殖分化与缺血区的血管再生；另一方面，细胞移植到梗死心肌后，可一定程度地补充由于大量心肌细胞坏死而变薄的心室壁。不同构建方法与策略的运用对细胞片移植前后的生物学活性都有直接的影响。目前，针对不同的种子细胞类型及其生物学特点，组织工程研究者已研究出多种细胞片构建方法，如温敏法、纳米磁性颗粒法等等，但是，上述这些方法，在接种细胞到补片材料中，通常都是均匀接种，但是，细胞在生长增殖过程中，由于不同细胞的状态不同，其增殖并不均匀，这就导致了补片上细胞的分布状态的不均匀，同时，造成心肌梗塞的因素不同，其在心肌上的心梗部位的形状，大小也会不同。采用现有技术制备的心肌补片由于细胞的分布状态的不均匀，有可能导致心肌梗塞部位的活性细胞较少，导致治疗效果欠佳，而心梗部位的形状，大小的不同，要达到全覆盖，通常也需要较大的补片，这就导致很多活性细胞其实覆盖与正常细胞中，造成了不必要的浪费和不可知的副作用。因此，获得一种制备简单，成本节约，且细胞能够集中覆盖于心肌梗塞部位的补片制备方法及其产品，是现有技术急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术中存在的上述问题，提供了一种制备心肌补片的方法，其可以使心肌细胞均匀的分布于补片材料上，也可以根据心肌梗死部位的心肌与大小，排列心肌细胞在补片的分布性质，其特征在于，所述制备心肌补片的方法采用介电电泳控制心肌细胞在补片材料均匀分布。在一个实施方式中，所述采用介电电泳控制心肌细胞在补片材料均匀分布具体为将心肌补片材料置于电极上，将心肌细胞悬浮于介电电泳缓冲溶液，将含有心肌细胞介电电泳缓冲溶液滴加至心肌补片材料上，向电极施加偏压电场，待细胞排列完成后，利用心肌培养液替换介电电泳缓冲溶液，进行培养。优选的，所述，介电电泳缓冲溶液为8.5％蔗糖、0.3％葡萄糖溶液用电导率仪测定悬浮液的电导率，以磷酸盐缓冲液(PBS)调解电导率为0.08S·m-1。在一个实施方式中，所述向电极施加的电场为以频率为1MHz的交流电压6Vpk-pk，共3分钟。在一个实施方式中，当细胞排列完成后，向介电电泳缓冲溶液加入6mMCaCl2和5mMMgCl2，提高细胞与补片材料的吸附。在一个实施方式中，所述采用介电电泳控制心肌细胞在补片材料均匀分布具体为，将心肌补片材料置于电极上；使心肌细胞悬浮于介电电泳缓冲溶液中，所述介电电泳缓冲溶液为为8.5％蔗糖、0.3％葡萄糖溶液，电导率为0.08S·m-1。将含有心肌细胞的介电电泳缓冲溶液滴加至心肌补片材料上，并提供频率为1MHz的交流电压6Vpk-pk，共3分钟。待细胞排列完成之后，在介电电泳缓冲溶液内添加入6mMCaCl2和5mMMgCl2，并以大约8μl/min的流速流动洗涤10分钟；以加入DMEM/F12细胞培养液替换介电电泳缓冲溶液，以大约8μl/min的流速流动洗涤15分钟后，于37℃、CO2的培养箱中进行培养。在一个实施方式中，所述细胞还可以是多能干细胞，优选的，所述多能干细胞为脂肪干细胞，间充质干细胞，骨髓干细胞。在一个实施方式中，所述心肌补片材料包括明胶，甘油，结冷胶，氧化石墨烯，多巴胺，伊桐苷，优选的，所述心肌补片材料，包括：明胶10-100份，甘油4-100份，结冷胶5-50份，氧化石墨烯3-10份，多巴胺0.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备心肌补片的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)制备心肌补片材料；(2)采用介电电泳控制细胞在补片材料均匀排布。

【技术特征摘要】
1.一种制备心肌补片的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)制备心肌补片材料；(2)采用介电电泳控制细胞在补片材料均匀排布。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为原代心肌细胞或多能干细胞，优选的，所述多能干细胞为脂肪干细胞，间充质干细胞，骨髓干细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的方法为：将心肌补片材料置于电极上，使心肌细胞悬浮于介电电泳缓冲溶液中，将含有心肌细胞介电电泳缓冲溶液滴加至心肌补片材料上，并提供频率为1MHz的交流电压6Vpk-pk，共3分钟；待细胞排列完成之后，在介电电泳缓冲溶液内添加入6mMCaCl2和5mMMgCl2，并以大约8μl/min的流速流动洗涤10分钟；加入DMEM/F12细胞培养液替换介电电泳缓冲溶液，以大约8μl/min的流速流动洗涤15分钟；所述介电电泳缓冲溶液为含8.5％蔗糖、0.3％葡萄糖的溶液，电导率为0.08S/m。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的方法为：(1)将明胶，甘油，结冷胶制备成透明的MA-Gelzan-Gly共混液；(2)将甲基丙烯酸酐加入到共混液，获得改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶；(3)将改性的MA-Gelzan-Gly水凝胶与氧化石墨烯混合，获得负载氧化石墨烯的MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶；(4)将MA-Gelzan-Gly-Go水凝胶与多巴胺、伊桐苷混合，以过硫酸铵为引发剂，TEMED为聚合助剂。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：将2g明胶在60℃条件下完全溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，获得10w/v％的明胶溶液，将0.8g的甘油溶于蒸馏水中，获得4w/v％的甘油溶液，将1g的结冷胶在60℃条件下溶于蒸馏水中，获得10w/v％的结冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建辉，郑俊，辛立明，杨子江，黄光涛，毕会民，胡刚良，
申请(专利权)人：嘉兴莱普晟医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33