一种间充质干细胞保存液及其保存方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种间充质干细胞保存液及其保存方法和应用，涉及干细胞保存液技术领域。本发明专利技术提供的间充质干细胞保存液包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.1％～0.5％、白蛋白0.2％～0.4％和余量生理盐水。利用本发明专利技术提供的保存液24h内干细胞存活率达到80％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞保存液及其保存方法和应用
本专利技术涉及干细胞保存液
，具体涉及一种间充质干细胞保存液及其保存方法和应用。
技术介绍
间充质干细胞可从各种组织中分离，如骨髓、脂肪组织、皮肤、骨骼肌和脐带血等。其中，源自脂肪组织的干细胞称为脂肪干细胞(ASC)(Gimbleetal.,2011)。通过最少的手术程序可以很容易地获得脂肪来源的干细胞，并且细胞产量高于典型的骨髓来源的间充质干细胞(MSC)(B.cousinetal.,BBRC301:1016,2003；A.Miranvilleetal.,Circulation,110:349,2004；S.Gronthoseetal.,J.CellPhysiol.189:54,2001；M.J.Seoetal.,BBRC,328:258,2005)。它被认为是最有用的间充质干细胞，因为它含有丰富的生长因子和细胞因子(Sgoddaetal.,2007,P.A.Zuketal.,TissueEng.7:211,2001；A.M.Rodriguezetal.,BBRC,315:255,2004)。由于这些优点，脂肪来源的干细胞已经广泛地用作医药目的的细胞治疗以及美容化妆品，其中包括不可治愈的疾病的治疗。当用作细胞治疗剂时，将培养的干细胞直接施用于患者时没有问题，但是当由于位置问题导致的运输需要长期保存细胞时保持高存活率是非常重要的。通常，使用细胞冷冻方法，其中细胞以约1℃/分钟的速率缓慢冷却，储存在约-200℃，并在储存后快速解冻，作为储存从活体分离的细胞的方法(SinhaNetal,2019,ErikJWetal,2009)。用于细胞长期储存的细胞冷冻存在的问题是，解冻时细胞的存活率非常低并且不能完全发挥干细胞的功能(AliEOetal,2019/WangWZetal,2013)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞保存液及其保存方法和应用。利用本专利技术提供的保存液24h内干细胞存活率达到80％以上。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.1％～0.5％、白蛋白0.2％～0.4％和余量生理盐水。优选地，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.3％、白蛋白0.3％和余量生理盐水。本专利技术还提供了上述技术方案所述保存液保存间充质干细胞的保存方法，包括：将所述保存液与间充质干细胞混合后，经冷藏和振荡后进行无氧保存。优选地，所述保存液的体积与间充质干细胞的个数比为(2～4)mL:(3×106～7×106)个。优选地，所述保存液的体积与间充质干细胞的个数比为3mL:5×106个。优选地，所述冷藏的温度为3～8℃。优选地，所述冷藏的温度为4℃。优选地，所述振荡的频率为40～50次/分钟。优选地，所述振荡的频率为44次/分钟。本专利技术还提供了上述技术方案所述保存液在提高间充质干细胞存活率中的应用。本专利技术提供了一种间充质干细胞保存液和保存方法。本专利技术提供的保存液的微环境与细胞内部细胞液的微环境更接近，细胞不会失水，细胞膜不会变形；本专利技术的保存液能够维持细胞渗透压的稳定；本专利技术保存液的pH值更适应细胞存活。利用本专利技术提供的保存液和保存方法24h内干细胞存活率能够达到80％以上。附图说明图1为人体脂肪中分离的脂肪干细胞的显微镜观察图，左侧为原图，中间和右侧分别为原图放大40倍和100倍的显微镜图；图2为CD13、CD29、CD44和CD34标记的脂肪干细胞电泳图；图3为不同含量玻璃酸钠对干细胞存活率影响图；0h～60h的柱形图分别从左到右依次为生理盐水、0.3％白蛋白、0.1％玻璃酸钠和0.3％白蛋白、0.3％玻璃酸钠和0.3％白蛋白、0.5％玻璃酸钠和0.3％白蛋白；图4为不同温度对干细胞存活率影响图；0h～48h的柱形图分别从左到右依次为4℃、20℃和37℃；图5为不同含量空气对干细胞存活率影响图；0h～60h的柱形图分别从左到右依次为0mL、0.5mL、1mL和2mL。具体实施方式本专利技术提供了一种间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.1％～0.5％、白蛋白0.2％～0.4％和余量生理盐水。本专利技术所述的保存液包括体积百分比为0.1％～0.5％的玻璃酸钠，优选为0.2～0.4％，更优选为0.3％。本专利技术对所述玻璃酸钠的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本专利技术中，所述玻璃酸钠具有提高间充质干细胞存活率的作用。本专利技术所述的保存液包括体积百分比为0.2％～0.4％的白蛋白，优选为0.3％。本专利技术对所述白蛋白的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本专利技术中，所述白蛋白具有提高间充质干细胞存活率的作用。本专利技术对所述生理盐水的来源没有特殊限定，常用常规市售产品即可。在本专利技术中，所述生理盐水优选常规培养间充质干细胞的生理盐水即可。本专利技术还提供了上述技术方案所述保存液保存间充质干细胞的保存方法，包括：将所述保存液与间充质干细胞混合后，经冷藏和振荡后进行无氧保存。在本专利技术中，所述冷藏能够降低细胞的代谢，延缓细胞的衰老，保持高存活率。所述振荡能够使细胞分布均匀避免粘连在一起。本专利技术对所述混合的方式没有特殊限定，采用常规的混合方法即可。本专利技术对所述间充质干细胞的种类没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本专利技术实施例中，优选采用脂肪间充质干细胞。在本专利技术中，所述保存液的体积与间充质干细胞的个数比优选为(2～4)mL:(3×106～7×106)个，更优选为3mL:5×106个。本专利技术对所述冷藏的方式没有特殊限定，优选采用温度为3～8℃，更优选为4℃的冷藏温度。本专利技术对所述振荡的方式没有特殊限定，优选采用摇臂NYC-80进行振荡。在本专利技术中，所述振荡的频率优选为40～50次/分钟，更优选为44次/分钟。本专利技术在保存过程中需要一直振荡，以防止细胞粘连在一起，容易导致死亡。本专利技术还提供了上述技术方案所述保存液在提高间充质干细胞存活率中的应用。在本专利技术中，所述间充质干细胞优选包括从骨髓、脂肪组织、皮肤、骨骼肌和脐带血中提取分离。下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1制备脂肪干细胞(1)通过吸脂术从人体腹部或大腿提取脂肪。将提取的脂肪和生理盐水以1:1的比例混合，并以300g离心3分钟以除去油，血液和盐水。将新鲜的纯脂肪提取三次。将1:1比例的I型胶原酶(SIGMA)和生理盐水混合的胶原酶溶液与脂肪以1:1的比例混合，酶反应在37℃下进行30～60分钟。除了通常用于胶原酶溶液的I型胶原酶之外，也可以使用对人类无害的人胶原酶，在这种情况下，反应时间不设定为30至60分钟。特别是，人体胶原酶对人体无害，无毒性，因此不需要中和过程。酶促反应后，在2000～2500g离心5分钟，分离出油脂层和干细胞层。此时，干细胞呈颗粒形式，通过使用补充有10％胎牛血清(FBS)(HYCLONE)的DMEM(HYCLONE)溶解沉淀获得脂肪干细胞(BanyardDA.etal,20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.1％～0.5％、白蛋白0.2％～0.4％和余量生理盐水。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.1％～0.5％、白蛋白0.2％～0.4％和余量生理盐水。2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：玻璃酸钠0.3％、白蛋白0.3％和余量生理盐水。3.权利要求1或2所述的保存液保存间充质干细胞的保存方法，其特征在于，包括：将所述保存液与间充质干细胞混合后，经冷藏和振荡后进行无氧保存。4.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于，所述保存液的体积与间充质干细胞的个数比为(2～4)mL:(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李承根，李松伊，成大一，张涛，徐源，
申请(专利权)人：深圳市未来细胞生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44