OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及喹噁啉类化合物的检测，具体涉及OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的OLA和MQCA免疫亲和柱，包括偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B；它是由CNBr活化的Sepharose 4B经溶胀后分别与OLA和MQCA的mAb偶联，然后对未偶联的活化位点进行封闭后而获得分别偶联有OLA、MQCA单克隆抗体的固相介质。本发明专利技术提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱，可以对目标物进行高效净化，回收率高、操作简单。

OLA and MQCA immunoaffinity columns and their preparation methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用
本专利技术涉及喹噁啉类化合物的检测，具体涉及喹乙醇和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用。
技术介绍
民以食为天，食以安为先。随着人民生活水平的提高，人们对食品的安全要求越来越高。喹噁啉类化合物(Quinoxaline,QELs)是一类具有抗菌活性的物质,主要通抑制DNA合成达到抗菌作用，广泛应用于畜禽动物和水生动物疾病的防治，喹乙醇(Olaquindox,OLA)是该类药物的典型代表物质。世界卫生组织和世界粮农组织等已经确定OLA的残留标示物为MQCA(3-甲基喹喔啉-2-羧酸)。目前有关喹噁啉类药物及其代谢物残留检测的仪器分析方法比较多，如气相色谱质谱联用(GC–MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱联用(LC–MS/MS)。样品前处理主要包括目标物的提取分析和对目标物的分离净化，其中对OLA与MQCA进行有效的富集净化是质谱定量分析的关键。近年来，在净化步骤，新型材料得到了较为广泛的关注和应用。然而由于动物可食性组织中内源性物质多，常规的液液萃取不能有效排除这些物质的干扰，尤其是在使用LC－MS/MS检测时，这些干扰物质会产生严重的基质效应，干扰检测器、增加基线噪音、降低柱效、阻塞色谱管路、污染色谱柱等。因此使用较多的是固相萃取净化方法。免疫前处理方法中免疫亲和层析(ImmunoaffinityChromatography，IAC)是目前发展较为广泛和成熟的分离手段之一。IAC是以抗原与抗体之间的特异性、可逆性结合反应为基础的亲和色谱，该方法具有其他方式不可比拟的选择性和极高的灵敏度(亲和常数高达1010-1012)，通常只需“加样-洗涤-洗脱”一步层析(one-stepsystem)就可使复杂样品中痕量的特定组分得到高度净化与浓缩，净化后的样品可直接用于GC、HPLC或HPLC-MS/MS分析，同时，IAC柱能方便地获得再生。所以，IAC在食品安全检测中有广泛应用，其优点是回收率高、操作简单、净化效果好等。
技术实现思路
为实现喹噁啉类化合物及其代谢产物的快速检测，本专利技术提供一种OLA和MQCA双层串联免疫亲和柱，可以对目标物进行高效净化，回收率高、操作简单。具体而言，本专利技术提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱，包括位于上部的偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和位于下部的偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，二者以筛板隔开；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose4B。研究发现，相对于直接将偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质混合装填于柱管中，本专利技术采用将二者以筛板隔开并且将偶联有OLA单克隆抗体的固相介质置于上部的优点在于同种固相介质的均匀分布可以有效避免空间位阻和竞争反应，保证目标物OLA和MQCA的充分吸附，更有利于对复杂样品基质中痕量或超痕量OLA和MQCA的特异性选择和高亲和分离。本专利技术所述上部是指距离免疫亲和柱上样口近的一端，而所述下部是指距离免疫亲和柱洗脱液出口近的一端。进一步地，免疫亲和柱中装填的所述偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质的厚度均优选为50mm。其优点在于保证充足的CNBr活化的Sepharose4B固相介质，偶联足够量的抗体，又不至于过厚而导致过柱堵塞现象。进一步地，本专利技术OLA和MQCA免疫亲和柱还包括底层筛板，用于承载所述偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质；顶层筛板，位于所述偶联有OLA单克隆抗体的固相介质上方；以及本领域常规组件例如用于封住底端的塞子和用于封住上端口的帽子。具体地，本专利技术是将由CNBr活化的Sepharose4B(琼脂糖凝胶4B)经溶胀后分别与OLA和MQCA的mAb(单克隆抗体)偶联，然后对未偶联的活化位点进行封闭后而获得分别偶联有OLA、MQCA单克隆抗体的固相介质。本专利技术还提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，包括如下步骤：(1)基质制备：取适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用1mM盐酸使其溶胀，抽滤，使用lmMHCl洗涤；(2)偶联：使用偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO3,0.5mol/LNaCl,pH8.4)洗涤步骤1)溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B；洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B分别转移到含有适量OLA单克隆抗体的偶联缓冲液中及MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中；混匀，柔和震荡反应；用所述偶联缓冲液分别洗去未偶联的OLA单克隆抗体、MQCA单克隆抗体，分别得到琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物；(3)封闭活性基团：将所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物分别转入0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，封闭所有残留的活性基团；(4)洗涤：依次用0.1mol/L醋酸-醋酸钠，pH4.0内含0.5mol/LNaCl的缓冲液和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0内含0.5mol/LNaCl的缓冲液分别洗涤步骤(3)所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物；以除去偶联后未偶联上的多余的配体；洗涤后用用200mLPBS充分平衡，分别制得偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，待用；(5)装柱：下层装填偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，上层装填偶联有OLA单克隆抗体的固相介质。上述制备方法中，偶联步骤较为关键，溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B经溶胀后应立即与含有单克隆抗体的偶联缓冲液混合。具体地，所述OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，包括如下步骤：(1)基质制备：称取1g基质粉末(CNBr-Sepharose4B，CNBr活化琼脂糖)，溶于5mL1mmol/LHCl中(1g基质5mL1mmol/LHCl溶胀，可得约3.5mL胶)。基质将会立即溶胀，然后置于砂芯漏斗(孔径：40–60μm)中使用1mmol/LHCl洗涤15min。使用大约1mmol/LHCl200mL，分次洗涤。(2)偶联：1°使用100mL偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO3,0.5mol/LNaCl,pH8.4)洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到30mL含有适量OLA或MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中。2°室温条件(20～25℃)下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物2h，或者在4℃下混匀过夜。也可以采用其他较为轻柔缓和的搅拌方法。3°在4℃5000rpm离心5min，将sepharose4B离心至管底，将上清液转移至新的离心管中，冰浴保存，用NanoDropOnec测定上清液在280nm下的OD值，从而计算偶联率。4°取离心管底的sepharose4B，使用至少5倍基质(gel)体积的偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体；(4)封闭1°封闭所有残留的活性基团。转移基质至50mL0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)中。室温条件下温和搅拌反应2h或者4℃条件下16h。2°为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种OLA和MQCA免疫亲和柱，其特征在于，包括位于上部的偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和位于下部的偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，二者以筛板隔开；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B。

【技术特征摘要】
1.一种OLA和MQCA免疫亲和柱，其特征在于，包括位于上部的偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和位于下部的偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，二者以筛板隔开；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose4B。2.根据权利要求1所述的OLA和MQCA免疫亲和柱，其特征在于，所述免疫亲和柱中装填的所述偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质的厚度均为50mm。3.一种OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基质制备：取适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用1mM盐酸使其溶胀，抽滤，使用1mMHCl洗涤；(2)偶联：使用偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO3,0.5mol/LNaCl,pH8.4)洗涤步骤1)溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B；洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B分别转移到含有适量OLA单克隆抗体的偶联缓冲液中及MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中；混匀，柔和震荡反应；用所述偶联缓冲液分别洗去未偶联的OLA单克隆抗体、MQCA单克隆抗体，分别得到琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物；(3)封闭活性基团：将所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物分别转入0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)中，封闭所有残留的活性基团；(4)洗涤：依次用0.1mol/L醋酸-醋酸钠，pH4.0内含0.5mol/LNaCl的缓冲液和0.1mol/LTris-HCl，pH8.0内含0.5mol/LNaCl的缓冲液分别洗涤步骤(3)所得琼脂糖-OLA单抗偶联复合物和琼脂糖-MQCA单抗偶联复合物；以除去偶联后未偶联上的多余的配体；洗涤后用用200mLPBS充分平衡，分别制得偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，待用；(5)装柱：下层装填偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，上层装填偶联有OLA单克隆抗体的固相介质。4.一种OLA和MQCA免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基质制备：称取1g基质粉末，溶于5mL1mmol/LHCl中；基质将会立即溶胀，然后置于砂芯漏斗中使用1mmol/LHCl洗涤15min；使用大约1mmol/LHCl200mL，分次洗涤；(2)偶联：1；使用100mL偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO3,0.5mol/LNaCl,pH8.4)洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到30mL含有适量OLA或MQCA单克隆抗体的偶联缓冲液中；2；室温条件下采用end-over-end的方式充分混匀上述的混和物2h，或者在4℃下混匀过夜；也可以采用其他较为轻柔缓和的搅拌方法；3；在4...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢洁，龚晓云，翟睿，黄泽建，刘梅英，曾伟杰，江游，戴新华，方向，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11